材料和试剂

血清移液管（5毫升，10毫升，25毫升）（康宁）
50ml聚丙烯离心管（Corning，目录号：430829）
T-25厘米2细胞培养瓶（Corning，目录号：430639）
100mm组织培养物处理的培养皿（Corning，目录号：430167）
用于SW41Ti转子（Beckman Coulter，目录号：344059）的超纯净离心管，13.2毫升，14×89毫米
15 ml聚丙烯离心管（Corning，目录号：430791）
4孔带载玻片（Thermo Fisher Scientific，Nunc，目录号：177437）
铝箔（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：01-213-102）
0.2微米大小的过滤器（Acrodisc注射式过滤器）（颇尔，目录号：4612）
Huh7.5细胞系（人肝癌细胞系）
Rep2a-Rluc细胞系：携带丙型肝炎病毒基因组长度复制子的Huh7.5细胞
LX2细胞（永生化人肝星状细胞）
DMEM培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16000044）
青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
不含CaCl 2和MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
ExoQuick-TC（System Biosciences，目录号：EXOTC10A-1）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
Alexa Fluor-647共轭小麦胚凝集素（WGA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：W32466）
4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼杂-3a，4α-二氮杂-s-引达省（BODIPY 493/503）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM TM >，目录号：D3922）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
甲醛溶液（在H 2 O中37重量％）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H6648）
BODIPY原液（见食谱）
Exosome耗尽血清（见食谱）
固定解决方案（见食谱）
渗透缓冲液（见食谱）
WGA结合物原液（见食谱）

设备

移液助剂
水浴
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall ST 8R）
37℃，5％CO 2细胞培养箱培养
倒置显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100，目标：10x）
SW41Ti转子（Beckman Coulter，型号：SW41Ti）
Zetasizer Nano（Malvern Instruments，型号：NanoSight LM10）
奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜（奥林巴斯，型号：FV1000，目标：60x）
生物安全柜
超速离心机（Beckman Coulter，型号：L8-80M）

程序

Huh7.5或Rep2a-Rluc（肝细胞）细胞系的复活
1. 在37℃水浴中快速融化冷冻的Huh7.5或Rep2a-Rluc细胞（〜1ml）。
2. 将Huh7.5或Rep2a-Rluc细胞的全部内容物转移到无菌的50ml锥形管中，并缓慢加入10ml预热的含有10％FBS和100U / ml青霉素和链霉素（完全培养基）的DMEM培养基。 />
3. 充分混合，并在室温下300×g离心10分钟。
4. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞沉淀，转移到T-25cm 2培养瓶中。
5. 培养细胞在37°C在5％CO 2孵化器。
6. 在倒置显微镜下使用10倍物镜观察培养瓶，并在实验前一天分开细胞。
  注意：复苏后的第二天，观察培养瓶中的浮游细胞。如果看到漂浮的细胞，用新鲜的5毫升完全培养基替换烧瓶。肝细胞瘤细胞应每3-5天以1：3至1：5的比例分裂以维持细胞生长。
BODIPY标签的外来体
1. 在100mm平板中播种约50％融合的2×10 6 Huh7.5细胞并在37℃下在5％CO 2培养箱中培养过夜。第二天，感染复数（MOI）为0.1的HCV感染细胞。在含有2％FBS和抗生素的最小体积（2ml）的DMEM中，让病毒吸附到细胞上8小时。用PBS清洗病毒感染的细胞3次。
  注意：血清浓度降低的培养基有助于病毒感染。
  在使用PBS前，应将PBS保存在室温下
2. 或者，在100mm平板中接种约80％融合的种子3-4×10 6 Rep2a-Rluc细胞，并在37℃下在5％CO 2培养箱过夜。第二天，用PBS清洗细胞3次。
3. 将10μl1mM BODIPY 493/503溶液（见配方）稀释到10ml培养基中，使最终浓度为1μM，充分混合并加到病毒感染的Huh7.5或Rep2a-Rluc细胞上。 />
4. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育细胞1小时
5. 用PBS清洗细胞3次。
6. 添加10毫升的新鲜DMEM介质与2％的exosome耗尽血清（见食谱）到细胞上，分别为HCV感染的Huh7.5或Rep2a-Rluc细胞孵育3天或24小时。
7. 孵育后，收集培养上清液并进行exosomes分离。
通过超速离心分离外来体
1. 收集来自HCV感染的Huh7.5或Rep2a-Rluc细胞的10ml培养物上清液，并在300℃下在4℃下离心5分钟。在不干扰细胞沉淀的情况下，小心地将上清液转移到新的超纯净离心管中。
2. 为了除去可能的细胞碎片，将上清液在4℃下以2,000xg离心10分钟，然后在4℃下用26,500xg离心30分钟，使用SW41 Ti转子超速离心。将上清液转移到一个新的超纯净离心管中。
3. 然后，使用SW41T1转子，在4℃下，通过超速离心将上清液在110,000×gg下离心90分钟以分离外泌体。丢弃上清。
4. 用PBS洗涤外来体小球2次。为此，将沉淀重悬于10ml PBS中并在4℃下以110,000×gg离心60分钟。丢弃上清液。重复这一步。
5. 将称为外来体的PBS中的最终沉淀重悬于原始体积的培养上清液的1/20用于分析。
6. 使用Zetasizer Nano（Malvern Instruments）通过动态光散射（DLS）检查外泌体的大小分布。通过DLS的外泌体的尺寸分布分析显示在图1中。外体尺寸以nm（d.nm）的直径测量，多分散性指数（PDI）指示样品内exosome的尺寸分布。
  
  图1.通过DLS（Nano-ZS90，Malvern）纯化的外来体的尺寸分布分析。从强度分布的平均值来看，Z平均值为202nm，多分散指数PDI为0.34。
用ExoQuick方法分离外来体
1. 从HCV感染的Huh7.5或Rep2a-Rluc细胞收集10毫升的培养上清液。
2. 为了除去可能的细胞碎片，在4℃以3000×g离心15分钟。将上清液转移到新的15ml锥形管中。
3. 在上清液（5毫升培养上清液和1毫升ExoQuick）中以5：1的比例添加ExoQuick，充分混合并在4°C孵育过夜。
4. 在4℃将细胞培养上清液和ExoQuick混合物在2000gxg离心30分钟。
5. 去除残留的上清液，并重悬在PBS中称为外来体的最终颗粒进行分析。
BODIPY标记的外泌体的摄取
1. 在含有10％FBS和100U / ml抗生素（完全培养基）的DMEM培养基中培养永生化人肝星状细胞系LX2。
2. 用聚-L-赖氨酸（0.01％）在37℃预涂覆4孔室玻片1小时。
3. 拆分LX2细胞，并在补充有2％exosome耗尽的FBS和抗生素的DMEM培养基中重悬细胞沉淀。
4. 在4孔室玻片的每个孔中种入1×10 4个LX2细胞。
5. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育细胞过夜
6. 第二天，用BODIPY标记的外泌体暴露LX2细胞3小时（短）或24小时（长）。
  注意：在加入到LX2细胞中之前，外泌体应在无血清培养基中从1：2稀释到1:10。不要将外来体直接添加到细胞上。由于外体被重新悬浮于PBS中，细胞与外体的更长时间的孵育将使细胞从腔室载玻片上分离。为了观察分子水平上的任何变化，如基因表达，应将外泌体与受体细胞一起孵育至少24小时。
7. 温育后，处理LX2细胞共聚焦显微镜观察外来体内化。
细胞染色共聚焦显微镜
1. 用固定液（3.7％甲醛，见配方）固定细胞20分钟
2. 用PBS清洗细胞3次。
3. 透化缓冲液（0.2％TritonX-100，见配方）在室温下透化细胞5分钟。
4. 用PBS清洗细胞3次。
5. 在室温（蓝色）下用DAPI（1μg/ ml）染色细胞核2分钟，并在共聚焦显微镜下观察。图2A中显示了代表性的图像。
6. 对于细胞边界或质膜染色，用5μg/ ml Alexa Fluor-647缀合的WGA（参见配方）在37℃孵育活的LX2细胞10分钟。
7. 用HBSS清洗细胞2次。
8. 修复细胞，并按照上述过程。代表性的图像如图2B所示。
  
  图2.肝星状细胞（LX2）对BODIPY标记的外泌体的内化。 BODIPY标记的外泌体从HCV感染的肝细胞的培养上清液中分离。用BODIPY标记的外泌体暴露LX2细胞3小时。 A.显示LX2细胞摄取BODIPY标记的外来体（绿色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光图像。 B.显示BODIPY标记的外来体（绿色），WGA（白色）被LX2细胞标记细胞边界和细胞核（蓝色）的摄取的免疫荧光图像。红色箭头表示BODIPY标记的细胞内的外泌体。这些图像是以60x2的放大倍数拍摄的。
  注意：
  1. 通过显微镜观察外来体标记的均匀性是非常困难的。他们太小，不能单独解决。通常，在显微镜下，BODIPY标记的外泌体倾向于聚集在一起。外泌体大小直径从50-150nm不等，然而，外泌体中的高蛋白质含量将直径增加到200nm。
  2. 两种常用的外来体分离方法的工作原理不同。超速离心涉及差速离心。连续循环的离心是为了连续沉淀凋亡小体，细胞碎片，脱落小泡，然后根据大小和密度分离外泌体。这是一个耗费时间的过程，涉及多个步骤并可能导致外泌体聚集。 Exoquick方法涉及基于聚合物的沉淀技术。有可能是外来体被微泡和凋亡小体污染，然而，通过这种方法可以从非常少量的样品中分离出外来体。

数据分析

每个实验重复至少三次以验证重现性。

食谱

BODIPY原液
1. 准备在DMSO中的5毫米（1.25毫克/毫升）原液。
2. 将原液储存在-20℃的铝箔包装中
3. 保护它免受光照，并制作更小的等分试样以避免反复冻融
4. 在实验时准备在DMSO中的1 mM工作溶液
Exosome耗尽血清
使用SW41Ti转子（Beckman Coulter）在4℃下以110,000×gg离心FBS 16小时，收集上清液，然后通过0.22μm过滤器。
将过滤的exosome耗尽的血清储存在4°C以备将来使用
固定解决方案

用PBS稀释37％的甲醛溶液制备3.7％的甲醛
透化缓冲液
加入2μl的Triton X-100在1 ml的PBS中在实验的时候一定要准备新鲜的缓冲液，并将其正确旋转。
WGA结合物储备溶液
1. 通过将5mg冻干粉溶解在5ml HBSS中制备1mg / ml储备液。
2. 将原液储存在-20℃的铝箔包装中
3. 保护它免受光照，并制作更小的等分试样以避免反复冻融

致谢

该协议是从以前发表的论文（Devhare等人，2017年）改编的。 Huh7.5，Rep2a-Rluc和LX2细胞系由美国纽约洛克菲勒大学的Charles M Rice，美国佛罗里达州佛罗里达州立大学的Hengli Tang和美国纽约西奈山医学院的Scott Friedman提供分别。作者声明不存在利益冲突。

参考

Devhare，P.B.，Sasaki，R.，Shrivastava，S.，Di Bisceglie，A.M.，Ray，R.和Ray，R.B.（2017）。丙型肝炎病毒感染的肝细胞与肝星状细胞之间的外来体介导的细胞间通讯 J Vir 91（6）。
Li，J.，Liu，K.，Liu，Y.，Xu，Y.，Zhang，F.，Yang，H.，Liu，J.，Pan，T.，Chen，J.，Wu， Zhou X.和Yuan Z.（2013）。外泌体介导IFN-α诱导的抗病毒活性的细胞间传递。 Nat Immunol 14（8）：793-803。
Qu，Z.，Wu，J.，Wu，J.，Luo，D.，Jiang，C。和Ding，Y。（2016）。来源于HCC细胞的外泌体在肝细胞癌体内均可诱导索拉非尼耐药性和体外。 J Exp Clin Cancer Res 35（1）：159.
罗摩克里希亚，V.，Thumann，C.，Fofana，I.，Habersetzer，F.，Pan，Q.，de Ruiter，PE，Willemsen，R.，Demmers，JA，Stalin Raj，V.，Jenster， Kwekkeboom，J.，Tilanus，HW，Haagmans，BL，Baumert，TF和van der Laan，LJ（2013）。外泌体介导的丙型肝炎病毒传染人肝癌Huh7.5细胞。美国国立科学院美国科学院 110（32）：13109-13113。
Schorey，J.S.，Cheng，Y.，Singh，P.P.and Smith，V.L。（2015）。在宿主 - 病原体相互作用中的外泌体和其他细胞外囊泡 EMBO Rep 16（1）：24-43。
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Sun，L.，Wang，X.，Zhou，Y.，Zhou，R.H.，Ho，W.Z.和Li，J.L。（2016）。外泌体有助于从TLR3激活的脑微血管内皮细胞向巨噬细胞传递抗HIV活性。抗病毒药物 134：167-171。