材料和试剂

用于哺乳动物细胞培养的24孔培养皿（SARSTEDT，目录编号：83.1836）
圆形玻璃盖玻片，13毫米（VWR，Marienfeld，目录号：630-1597）
注意：高压灭菌，用40％乙醇/ 60％HCl预清洗1小时，并在RT下用Milli-Q水洗涤4次，每次15分钟;用200μl0.1％（w / v）聚-D-赖氨酸在37℃，5％CO 2和20％加湿的培养箱中，用无菌的Milli-Q水洗涤3次。
超级玻璃滑梯（MENZEL GERHARD，产品目录号：2586E）
塑料巴斯德吸管（SARSTEDT，目录号：86.1171）
Parafilm（Fisher Scientific，目录号：11782644）
制造商：Bemis，Parafilm，目录号：PM999。
野生型雌性和雄性小鼠胚胎（Balbc，胚胎第16天; Charles River）
APP-RFP质粒（Szodorai等人，2009）（S.Kins，凯泽斯劳滕大学）
0.1％（w / v）聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1149）
电镀介质：
1. DMEM，高葡萄糖，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11995065）
2. 10％胎牛血清（FBS），合格的，热灭活的，美国来源（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：16140071）
3. 1％青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
神经基础培养基：
1. 神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21103049）
2. 2％B-27补充剂，定制（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：0080085SA）
3. 0.1％GlutaMAX TM补充物（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：35050038）
胰蛋白酶（2.5％），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15090046）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985062）
鼠抗APP N-末端单克隆（22C11）（Merck，目录号：MAB348）
HEPES（1M）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630080）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010031）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
蔗糖（NZYTech，目录号：MB18601）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
驴抗小鼠Alexa 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21202）
盖玻片安装解决方案（FluoroMount-G）（SouthernBiotech，目录号：0100-01）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
HBSS（GE Healthcare，Hyclone TM，产品目录号：SH30031.03）
无菌水中含50％葡萄糖（NZYTech，目录号：MB16801）
牛血清白蛋白V（BSA）（NZYTech，目录号：MB04602）

设备

CO 2培养箱用于原代细胞培养（BINDER，型号：CB 160）
计数室（Belden，Hirschmann，目录号：8100103）
Epifluorescence直立式显微镜Z2（Carl Zeiss，型号：Axio Imager Z2）配备了60x NA-1.4油浸物镜和AxioCam MRm CCD照相机（Carl Zeiss）

软件

ImageJ软件（可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 免费下载）
GraphPad Prism 6（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

注意：在体外培养9天的神经元上进行APP胞吞作用试验（9DIV）。

细胞培养和转染（第1天，第6天，第8天）
1. 第1天：如先前所述（Almeida等人，2005和2006; Ubelmann等人），从野生型雌性和雄性小鼠胚胎（E16）制备来自皮层和海马的原代皮层神经元，2017）。简而言之，将解离的神经元接种在含有聚D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片（5-10×10 4细胞/ cm 2）的24孔平板上， DIV 0）。 3小时或过夜后，用Neurobasal培养基更换电镀培养基，只允许神经元生长和分化，直到使用。（Almeida等人，2005和2006; Ubelmann等人，2017），
2. 第8天：为了表达APP-RFP cDNA，根据制造商的方案，用Lipofectamine 2000瞬时转染8个DIV初级皮质神经元，使用0.5μgcDNA：0.5μlLipofectamine混合物在25μlOpti-MEM中，每孔24-孔板250微升新鲜无抗生素Neurobasal培养基，孵育过夜，直到测定APP内吞。
  注意：在分化的第5阶段，平均期望10个转染的健康神经元在8个DIV处（Dotti等，1988），并且神经突不应显示指示退化的珠状结构。使用新制备的cDNA和常规的midi-prep试剂盒（我们使用当地的NZYTECH品牌）可以达到这一效率。
3. （可选）第6天：对于敲低分析，在用新鲜无抗生素的Neurobasal替代培养基后，使用Lipofectamine RNAiMax，使用Lipofectamine RNAiMax，用siRNA转染6天体外原代神经元（6DIV）中等。
通过以下步骤（第9天）表达9个表达APP-RFP的DIV初级神经元的APP胞吞作用测定（图1）

图1.使用抗APP抗体在轴突，树突和细胞体中温育10分钟监测的APP胞吞作用的示意图。EE：早期内体; Lys：溶酶体。
1. 用塑料巴斯德吸管移出细胞培养基，加入400μLB27免费Neurobasal培养基30分钟在37°C在细胞培养孵化器。所有的移液都应该慢慢地靠在井壁上，而不要接触细胞。
2. 将25μl抗APP抗体（22C11;0.25μg/μl原液浓度）稀释到25μl完全Neurobasal培养基中，每个盖玻片含10mM HEPES（0.25μl储备液，1M，pH7.2-7.5）。
3. 将每个玻璃盖玻片上的25μl稀释的抗APP抗体滴在24孔板盖上的Parafilm上。
4. 将盖玻片小心并尽可能快地覆盖在面对抗体溶液的细胞的液滴上，盖上容器中的反应物以避免蒸发，并在37℃下在细胞培养箱中孵育10分钟。这个步骤允许抗APP抗体结合到细胞表面APP和随后的内吞作用。
  （可选）
  1. 为了监测胞吞的APP溶酶体降解，通过在500μl预热的PBS中一次浸渍盖玻片一次4s进一步孵育细胞60分钟。
  2. 为了在质膜上检测APP，在37℃下在细胞培养箱中用抗APP抗体孵育细胞仅4分钟。这个可选的步骤允许标记抗APP抗体绑定到细胞表面的APP没有显着检测内吞作用。
5. 在500μl预热的PBS中浸渍4次，每次盖上盖玻片
6. 通过将盖玻片放回到24孔板中并在室温（RT）下加入500μl4％多聚甲醛/ 4％蔗糖20分钟来固定细胞。用500μlPBS代替固定液，洗3次后进行抗APP检测。
抗APP抗体检测（第9天）
1. 为了检测与抗APP抗体结合的内吞的APP，在室温下用500μl0.1％皂苷/ PBS（透化缓冲液）透化固定的细胞60分钟。去除透化缓冲液，并用PBS清洗每个盖玻片。
  可选：为了在细胞表面检测与APP结合的抗APP（4分钟），不需要透化。不要在步骤C2和C3中加入皂苷。
2. 用500μl封闭缓冲液（3％FBS / 0.1％皂角苷/ PBS）在室温封闭抗体与血清蛋白的非特异性结合60分钟。
3. 将每个盖玻片（细胞朝下）放在50μL3％FBS / 0.1％皂素/ PBS稀释的驴抗小鼠Alexa 488（1：250）液滴。
  可选：将DAPI包含在抗体溶液（1：10,000的1毫克/毫升的股票）中以使细胞核复染。
4. 覆盖反应，并在室温下孵育60分钟，在黑暗中。
5. 将盖玻片放回到24孔板上，在室温下用PBS清洗3次。
6. 在显微镜载玻片上放置盖有细胞的细胞，将细胞面朝下放在25μlFluoromount G液滴上，并在黑暗中干燥过夜以保持荧光信号。
  注意：快速移取Fluoromount G以防止其干燥，但要轻轻地避免气泡。
图像采集（第10天）
图像采集是使用epifluorescence显微镜（如蔡司Z2）与60x NA 1.4油浸物镜和CCD相机（见设备的细节使用显微镜）。有关代表性图像，请参见图2。
1. 神经元细胞体，部分树突和轴突必须集中。应该排除表达低或高水平的APP-RFP的发育不良的神经元或神经元。曝光时间应根据具有最明亮的预期信号的样本来确定，以便尽可能多地使用相机的动态范围（理想情况下使用具有16位二进制范围的相机），而不使任何像素饱和。
2. 每个条件获得10-20个神经元，以获得足够的数据进行统计分析。为了对整个神经元进行成像，可能需要获取多个场。
  
  图2.表达APP-RFP的原代神经元的APP内吞作用的代表性图像，其中用抗小鼠Alexa 488检测的抗APP（22C11）温育10分钟.Dd：树突;斧：轴突;比例尺=10μm（由Ubelmann等人改编，2017）。
图像分析与放大APP胞吞作用在细胞体，树突和轴突中定量（图3）（第10-11天）
注意：使用ImageJ / Fiji获得的内吞荧光信号的定量
1. 根据神经元形态学和RFP信号确定细胞体，树突和轴突，并粗略地勾画与细胞体对应的复合体选择（非邻接的ROI），树突中2至5μm〜20μm区段和轴突中的一个（通常更薄，更长，并在90°角有分支）使用“多边形选择”，同时按下“移位”（见图3）。轴突和树突也可以用Ankyrin-G（Santa Cruz Biotechnology）或MAP2（Sigma-Aldrich）复染。
  
  图3. APP内吞作用的图像分析：第1步
2. 复制包含复合选项的图像（shift + D），并使用“清除外部”来移除未选中的像素（见图4）。
  
  图4. APP胞吞作用的图像分析：第2步
3. 将ROI细化到细胞边界：自动“阈值”细胞体中的APP-RFP信号;通过用“魔杖”点击阈值的神经突，创造一个新的投资回报。将ROI添加到“ROI manager”（shift + t）（参见图5）。
  
  图5. APP内吞作用的图像分析：第3步
4. 为了提高树突和轴突的ROI：如果必要的话，调整树突和轴突中的APP-RFP信号的自动“阈值”通过用“魔杖”点击阈值的神经突，创造新的投资回报。将ROI添加到“ROI manager”（shift + t）（参见图6）。
  
  图6. APP内吞作用的图像分析：第4步
5. 将所有区域转移至内吞的Alexa488抗APP通道，使用工具“多边形选择”在无细胞区域绘制背景ROI，并将其添加到“ROI管理器”。在ROI管理器中，按“测量”以获得每个ROI（背景，细胞体，树突和轴突）的平均Alexa488-抗APP荧光强度。选择，复制和导出测量到Microsoft Excel（见图7）。
  
  图7. APP内吞作用的图像分析：第5步
6. 将所有区域转移回APP-RFP通道，并在ROI管理器中按“测量”以获得每ROI（背景，细胞体，树突和轴突）的平均APP-RFP荧光强度。选择，复制和导出测量结果到Microsoft Excel（见图8）。
  
  图8. APP内吞作用的图像分析：第6步

数据分析

注意：数据分析是使用Microsoft Excel完成的。

每个单个神经元的所有测量值减去背景平均荧光强度
通过细胞体中的APP-RFP荧光强度来标准化Alexa488-抗APP荧光强度（来自3个神经元区室）以控制每个单个神经元的APP-RFP的不同表达水平。
如果数据遵循正态分布，则可以使用经典的 t 测试来比较不同的条件。
根据以前的研究，在每个独立实验中样品大小为每个条件约20个细胞。对至少三个独立实验的统计学显着性是通过双尾Student的吨 -test和用于多重比较单向ANOVA与Tukey检验使用关于正常的数据（达戈斯蒂诺皮尔森总括正态性检验）来确定GraphPad棱镜6.
非参数数据的统计显着性通过Mann-Whitney检验来检验。

笔记

可变性通常是由于原代神经元的培养;
在独立实验中，分化程度应保持不变
在我们的手中，APP内吞是稳健的，平均结果非常可重复。但是，在同一个实验中，不同神经元之间的差异是可以预料的。
对于最佳的APP转染和实验条件，高质量的DNA质粒和健康和发达的原代神经元是至关重要的。

致谢

我们感谢S.Kins博士（凯泽斯劳滕大学）的APP-RFP质粒。这项工作得到了CEDOC和玛丽•居里综合补助金（334366 TrafficInAD FP7-PEOPLE-2012-CIG; Marie Curie Actions，EC）的支持。 iNOVA4Health-UID / Multi / 04462/2013是一个由FundaçãoparaCiênciae Teologologia（FCT）/EducaçãoeCiênciaMinistériodaEducaçãoeCiência资助的计划，由FEDER根据PT2020合作协议共同资助。 CGA是Investigator FCT（IF / 00998/2012，FCT）。 FU获得FRM博士后奖学金（SPE20130326599）和FCT博士后奖学金（SFRH / BPD / 94186/2013）。这个协议是根据我们最近在EMBO报告中发表的（Ubelmann等人，2017）。作者宣称没有利益冲突。

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