材料和试剂

0.2ml PCR管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：AB0620）
10μl过滤吸头（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1121-3810）
10μl移液枪头（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1111-3810）
200μl移液枪头（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1111-0810）
200μl过滤吸头（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1120-8810）
1,000μl移液枪头（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1111-6810）
直径为47毫米的1.2微米等孔过滤器（默克，目录号：RTTP04700）（可选）
1.5ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：11926955）
直径90mm的培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：263991）
0.7微米（M10）钨颗粒（微载体）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652266）
培养管（Fisher Scientific，目录号：11317824）
大载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652335）
Macrocarrier holder（Bio-Rad Laboratories，产品目录号：1652322）
停止屏幕（Bio-Rad Laboratories，产品目录号：1652336）
1350psi爆破片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652330）
Thalassiosira pseudonana CCMP 1335（Bigelow） https://ncma.bigelow.org/ccmp1335
具有One Shot TM TOP10 E的pCR TM TM / GW / TOPO TM TA克隆试剂盒。（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：K250020）。
高效率的主管E。（New England Biolabs，产品目录编号：C2987H）（例如，NEB 5-alpha Competent E.coli（高效率））。
Bsa（新英格兰生物实验室，目录号：R0535S）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：ER1011）
Taq DNA聚合酶（例如，GoTaq Flexi DNA聚合酶）（Promega，目录号：M8291）
pICH47732：FCP：NAT（Addgene，目录号：85984）或pICH47732（Addgene，目录号：48000）
pICH47742：FCP：Cas9YFP（Addgene，目录号：85986）或pICH47742（Addgene，目录号：48001）
pICH47751（Addgene，目录号：48002）
pICH47761（Addgene，目录号：48003）
pICH41780（Addgene，目录号：48019）
pAGM4723（Addgene，目录号：48015）
pICH86966 :: AtU6p :: sgRNA_PDS（Addgene，目录号：46966）
pCR8 / GW：U6（Addgene，目录号：85981）
Q5定点突变试剂盒（新英格兰生物实验室，目录号：E0554S）
高保真度DNA聚合酶（例如Phusion High-Fidelity DNA Polymerase）（New England Biolabs，目录号：M0530）
PCR清洁试剂盒（例如，Illustra GFX PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒）（GE Healthcare，目录号：28-9034-70）
质粒小量制备试剂盒（，例如，PureYield质粒小量制备系统）（Promega，目录号：A1223）
无水乙醇（VWR，目录号：20821.330）
琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：17850）
用于凝胶电泳的溴化乙锭（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15585011）
用于凝胶电泳的TAE缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：15558026）
T4 DNA连接酶（Promega，目录号：M1794）
5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷（X-Gal）（Sigma-Aldrich，目录号：B4252-50MG）
IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758-1G）
半盐度Aquil媒体（价格，1989年，完整的食谱在：
Nourseothricin clonNAT（Werner BioAgents）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670-100G）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S0266-1G）
异丙醇（VWR，目录号：BDH1133-1LP）
压缩氦气供应
Mix2seq套件（Eurofins）
胰蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：T7293）
酵母提取物（ForMedium，目录号：YEA01）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
琼脂（ForMedium，目录号：AGA02）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A0166-5G）
大观霉素二盐酸盐五水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S4014-5G）
羧苄青霉素二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：C3416-250MG）
卡那霉素硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：60615-5G）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
Tris-HCl pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：15568025）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
LB培养基/ LB琼脂（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，型号：Finnpipette，体积：2μl，10μl，200μl和1,000μl）
NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 1000）
层流罩（Walker安全柜，型号：Class II 1290 Recirc Gen 6）
台式微型离心机（Eppendorf，型号：5418 R）
离心机（海蒂诗实验室技术，型号：ROTINA 380 R）
高压灭菌器（Prestige Medical，目录号：210004）
镊子
涡（Mo Bio Laboratories，型号：Vortex Genie 2）
摇动培养箱（37°C）（IKA，型号：KS 4000 i control）
在20°C的光照培养箱（三洋多功能环境测试室）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM热循环仪）
用于计数细胞的光学显微镜和Neubauer室（VWR，目录号：631-0696）或Coulter Counter（Beckman，型号：Multisizer 3）
PDS-1000 / He生物射弹微粒输送系统（粒子枪）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652257）
用于细胞过滤的真空泵（Welch Vacuum，型号：2534C-02）（可选）
Nalgene过滤漏斗（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：DS0320-5045）（可选）
用于微粒输送系统的高真空泵（Uniweld Products，型号：HUMM•VAC HVP6）
凝胶电泳槽（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，型号：Midi Plus水平凝胶系统）
电泳电源（配套，型号：EV243）

程序

设计sgRNAs
sgRNA被设计成一旦引入突变便于筛选。该协议描述了两种筛选方法：带移位测定和限制性位点丢失。我们发现带移位测定法是最有效的 - 这种方法是基于使用两种sgRNA引入缺失，所述sgRNA可以通过扩增靶并在琼脂糖凝胶上寻找更短的带来进行筛选。它具有引入非常精确和大量删除的附加好处。这可以作为一个独立的方法，而不需要限制站点的丢失。限制性位点丢失稍微复杂一些，并且限制了sgRNA的设计，因为DSB需要与限制性识别位点（优选至少5nt位点切割位点）重合。当通过CRISPR-Cas引入突变时，限制性位点不再有活性，限制酶不能切割。这个方法已经包含了，因为如果只有一个sgRNA有功能的话，它可以是富集突变目标或筛选的有用方法。
1. 该协议使用嵌合sgRNA与S一起使用。 pyogenes Cas9的序列如下：
  NNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC的 TTTTTT
  1. 带下划线的序列显示了与基因组中20nt靶序列相对应的可编程区域。
  2. 在基因组中，这个序列紧接着是NGG PAM。因此需要在基因组中用序列N 20 NGG来鉴定靶标。
    注意：sgRNA本身的目标序列应该只包含序列 - 即它不应包含PAM。
  3. 另外，使用募集RNA聚合酶III（pol III）的U6启动子来驱动小的非编码sgRNA的表达。这意味着sgRNA需要以“G”开始以激活转录。这可以被结合到目标设计中，这意味着需要识别具有序列GN19 NGG的目标，或者可以将额外的G添加到sgRNA的5'端。
  4. 使用pol III表达sgRNA时，粗体字6的字符串作为转录的终止子。＆nbsp;＆nbsp;
2. 使用两种工具来设计sgRNA靶：
  1. RGEN Cas-Designer： http://www.rgenome.net/
    1. 包括几个藻类和硅藻基因组的非目标查找器，包括T。 pseudonana 。这使得研究人员可以拒绝目标，如果类似的序列发生在基因组的其他地方，也可能会被削减。
    2. 允许指定的序列被省略，如内含子。
    3. 如果研究人员希望更改Cas9，可以搜索具有多个不同PAM的目标。
  2. Broad Institute sgRNA设计师： https://portals.broadinstitute.org/gpp/公共/分析工具/ sgrna-设计
    这是用来给目标的分数。该程序使用的算法是基于经验测试的sgRNA，并预测其切割效率。尝试选择切割效率尽可能接近1的目标。
3. 设计两个切割位点相距约50-100 bp的sgRNA
  1. 删除50-100bp使得编辑的目标与WT之间有明显的区别（Belhaj等人，2013; Brooks等人，2014）。 > 注意：如果需要，可以选择更大的缺失 - 研究表明较大缺失的突变发生较少，但是直到10kb的缺失仍然有效（Zheng et al。，2014）。
  2. 如果预期有帧移动，则可以靶向基因的活性位点或基因的起点。
    注意：整个基因也可以通过靶向基因的末端或终止子/启动子的末端来去除。如果活性位点是未知的，或者在设计sgRNA时存在问题，例如当存在大量的重复序列时，这可能是有用的。
4. 如果使用限制性丢失的方法进行筛选，则需要设计靶标，使得Cas9切割位点位于限制识别位点或位于删除位点内。
  可以使用诸如Phyto CRISPRex（Rastogi等人，2016）之类的软件或通过限制发现者（诸如浮雕限制工具（））运行目标基因来确定将位点限制在限制性位点上的目标和限制性位点的交叉引用位置与Cas9切割位置的交叉参考位置网站/删除。
  注意：设计完全符合这些规范的sgRNA可能并不总是可能的，例如，由于定位限制，可能需要使用具有较低目标分数的sgRNA（我们已成功使用了评分为0.4的sgRNA），或者稍小的删除可能是必要的。请记住，即使有可能，目标仍然需要经验测试，因为其他因素，如无障碍可能会影响他们的活动。因此，建议为每个目标基因/序列设计至少两组sgRNA。

构建
使用Golden Gate系统组装构建体，该系统使用预先设定的主链和序列之间的预设突出端来建立模块中的质粒（Weber等人，2011）。金门克隆背后的基础是使用在限制性识别位点外切割的限制性酶BsaI和BpiI，从而产生特定的4nt突出端。这允许片段以特定顺序连接在一起，并且在每个级别的单个反应内。由于限制识别位点和切割位点是分开的，插入物的限制性消化和连接导致完全移除位点，这意味着一旦实现正确的组装，构建体就不能再被切割。这是在三个级别上进行的，L0，L1和L2。
L0模块含有序列，如启动子，编码区和终止子。这些组装在一起形成L1骨干中的盒子。然后将L1模块组装到最终的L2骨架中以创建具有CRISPR-Cas所需的所有必需序列的构建体。本节将介绍 T中用于CRISPR-Cas的构建组件。 pseudonana 用于靶向基因组中的两个位点，然而，它可以很容易地适用于其他生物体，不同的模块（例如，不同的Cas9，启动子或选择性标记）比两个网站。后者使这种克隆方法适用于多个基因的目标。
L1骨干包含BsaI站点以允许克隆L0模块以及BpiI站点以允许将L1模块克隆到L2骨干中。通过用Taq DNA聚合酶扩增所需片段并克隆入pCR TM 8 / GW / TOPO载体来产生L0模块。为了将L0模块克隆到L1骨架中，当扩增所需片段时，需要通过正向和反向引物来包含<！> Bsa I位点。另外，消解 Bsa I站点时创建的突出部分需要在相邻模块之间相同。在这个协议中使用的所有L1主链在用 Bsa I消化时给出GGAG和GCTT的标准化突出端。结果，要克隆的序列中的第一个L0模块必须在5'端包含GGAG突出端，并且最后一个模块在3'端必须包含GCTT突出端。 L0模块之间的内部悬垂由研究人员决定，可设计为无缝连接。下面是一个克隆到L0的扩增子的例子，显示序列的开始和结束：

Ť的 GGTCTC 一个 GGAG AGCTTGCGCTTTTTCCGAG ... CTGATTTACCAA ACCAATACCAA AATG 吨的 gagacc < / strong> t

粗体字母表示BsaI位点，下划线区域显示由限制性酶切位点产生的4nt突出端，斜体区域显示岩藻黄素叶绿素a / c结合蛋白（ FCP）启动子序列。第一个突出部分与L1主干结束处的突出部分相对应。第二个突出部分与相邻的Cas9模块的突出部分相对应。这样做的目的是为了在Cas9的开始部分包含ATG，从而实现无缝连接。
图1给出了在这个协议中使用的汇编过程的一般概述。

图1.用于装配CRISPR-Cas构建体的Golden Gate克隆系统的概述。对于 T。 pseudonana，L0 U6启动子，L1 FCP：NAT盒和L1 FCP：Cas9：YFP盒的质粒已经可以从Addgene获得（参见以下链接）。额外的L0 em。 pseudonana 模块请联系作者。
1. 该协议描述了所有模块的创建和组装，以便研究人员可以根据需要修改整个系统，但是，所描述的一些L0和L1模块已经可以从Addgene获得 https://www.addgene.org/Thomas_Mock/ 。另外，在同一个网站上很快就可以从Addgene获得 P. tricornutum 的模块。

数据分析

使用如上所述的带位移测定和/或限制性位点丢失进行筛选。这使得测定产物能够在凝胶上运行以通过缺失（带移测定）或靶位点突变（限制性位点缺失）容易地确定基因组编辑。然后对产物进行测序以确认缺失/突变。
对于30-40个菌落的主要克隆进行Cas9和缺失的检测。
注：我们对来自所有原代菌落的PCR产物进行了测序，无论是否存在Cas9或缺失，发现11％的克隆含有Cas9。具有Cas9的100％的克隆含有突变-75％的突变克隆含有缺失，但是其余的25％在一个靶位点处显示具有与WT类似的带的突变。因此，可以将Cas9作为潜在突变的指标进行筛选，因为编辑可能并不总是导致删除。然后可以如所描述的那样对Cas9克隆进行亚克隆，并进行进一步分析，包括限制性位点丢失和测序。
大约30个亚克隆通常通过带移测定来测定以确定双等位基因缺失的频率。这被计算为与只有较低的带（指示两个等位基因中的缺失）的亚克隆的数目相比，所测试的亚克隆的总数。其他菌落可能只给出较高的WT带或两者的混合物。
进一步的分析取决于哪个基因/序列正在被靶向。例如，当靶向尿素酶基因（其允许细胞使用尿素作为氮源）时。假单胞菌（pseudonana），使细胞系在硝酸盐（阳性对照）或尿素作为唯一氮源的培养基中生长（Hopes等人，2016）。每天测量一次细胞计数和细胞大小，直到达到稳定期。然后比较细胞系（WT和突变体）和生长条件（硝酸盐或尿素）之间的生长曲线/细胞大小，以确定编辑的细胞系中的氮饥饿或限制。

食谱

LB培养基/ LB琼脂

将胰蛋白胨，酵母提取物和氯化钠组合。如果制作平板也加琼脂。用MilliQ /蒸馏水和高压灭菌器补足1L。一旦介质冷却到50°C，如果选择性培养基添加相关的抗生素。一旦介质已经达到50°C，板也被浇注。配方可根据需要放大或缩小
裂解缓冲液

致谢

感谢塞恩斯伯里实验室提供的金门目标载体和连接器。这项工作是由自然环境研究委员会（NERC）授予Amanda Hopes的博士生资助的。 TM承认NERC（NE / K004530 / 1）和诺里奇东安格利亚大学环境科学学院的部分资金。
作者贡献：AH和TM构思了这个项目。 AH设计并开发了Golden Gate克隆和Vladimir Nekrasov带移测定法的输入方案。 AH和NB确定了F. cylindrus的U6启动子，IG在同一物种中测试了它的活性。 AH写了这篇文章。
该协议基于Hopes等人（2016年）提出的工作。
作者声明他们没有竞争利益。

参考

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Brooks，C.，Nekrasov，V.，Lippman，Z.B。和Van Eck，J。（2014）。第一代番茄的高效基因编辑使用聚类规则间隔短回文重复序列/ CRISPR相关9系统。植物生理学 166（3）：1292-1297。

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