材料和试剂

薄胶带
硅橡胶复合物（化学试剂;地址：中国合肥科学路110号402室F9室电话：0551-62329017）
海绵
牙签
塑料管
2.5毫升注射器
1.5毫升无RNA酶的试管（Corning，Axygen®，产品目录号：MCT-150-C）
蜜蜂（ Apis mellifera ligustica）
冰
柠檬精华（Queen Fine Foods， https://queen.com.au/product /天然柠檬萃取物-50ml / ）
香草精华（Queen Fine Foods， https://queen.com.au/product / natural-vanilla-extract-200ml / ）
液氮
氯化钠（NaCl）
蔗糖
1 M蔗糖溶液（见食谱）
饱和盐溶液（见食谱）

设备

金属管（由江西南昌的一家当地机械厂制造，直径1厘米，长度2厘米，由铜制成）
孵化器（韶关泰兴医疗器械公司，型号：LRH-250A）
小吸风扇
剪刀

程序

在这个实验中，我们使用了来自一只来自Apis mellifera ligustica的单一无人授精（SDI）女王的工蜂。工蜂出现后的第八天早上我们开始PER实验。我们从矩形框中移除蜜蜂，随机分配到三组：左侧天线覆盖（LAC），右侧天线覆盖（RAC）和控制。这导致两个训练组（LAC和RAC）和一个未训练组（对照）。我们在蜜蜂冰上冷却约5分钟，直到它们停止移动（Letzkus et。，2006年）。
我们把每个蜜蜂都固定在一个带有细条的金属管里，这样只有两个前腿和头部可以自由移动。对于两个训练组，他们的天线之一覆盖有双组分硅橡胶化合物，以确保蜜蜂由一个天线训练。当我们覆盖触角时，我们把蜂头放在海绵上。在混合两种硅橡胶混合物之后，我们在混合物中蘸一根牙签，然后用混合物小心地覆盖蜜蜂的天线。相反，对照组蜜蜂的天线是空闲的（图1A）。接下来，所有的蜜蜂都简单地喂一两滴1M蔗糖溶液（见食谱），然后移回孵化器恢复。
注意：蜜蜂在孵化器内仍然固定在金属管中。
两个小时后，我们用积极的刺激和消极的刺激来训练蜜蜂。蜜蜂现在不需要麻醉，因为它们固定在管中。在这个实验中，柠檬气味+ 1M蔗糖溶液被用作正刺激+奖励，而香草气味+饱和盐水溶液（见食谱）被用作负刺激+惩罚。我们把气味与奖励或惩罚混合在一起。更具体地说，我们添加30微升柠檬气味4毫升1M蔗糖溶液和30微升香草精华4毫升饱和盐水（27.74％，W / W）。蜜蜂被训练来区分这两种不同的气味。在训练过程中，蜜蜂首先得到刺激，然后进行适当的奖励或惩罚。我们在蜜蜂后面放置一个与塑料管连接的小型吸风扇，以在刺激过程中保持恒定的气味流动（图2）。风扇还可以让我们在开始下一个蜜蜂训练之前迅速清除残留的痕迹。（图1B）。

图1. PER实验。：一种。硅橡胶复合天线覆盖; B.用蔗糖水喂养蜜蜂; C.两只天线被发现的对照组蜜蜂。

图2.抽风机设置示意图
蜜蜂每隔6分钟进行三次试验。每个审判包含积极和消极的刺激训练（Masutaro，1957）。
1. 在第一次试验中，蜜蜂获得积极的条件刺激。使用2.5毫升针头注射器从蜜蜂的触角放置约1-2厘米的液滴。蜜蜂伸出长鼻后，将其取出，并尝试解决方案。如果蜜蜂在5秒内没有伸出它的长鼻，我们用刺激下降的方式短暂触摸天线，以提示它对气味做出反应。
2. 然后，蜜蜂被给予与上述相同的程序的负面刺激。
3. 如果一只蜜蜂从来没有延长它的长鼻，或者没有活动，它在第一次审判后就被丢弃了。
4. 培训结束后，蜜蜂喂2-3滴1M蔗糖溶液，并返回孵化器过夜储存。
在第二天早上，进行保留测试。对于LAC和RAC组，在保留测试完成之前，硅橡胶不会被除去。对于保留测试，蜜蜂首先被给予负面刺激，然后是正面刺激。就像在训练中一样，刺激液滴放置在离蜜蜂触角1-2厘米处，我们等待5秒钟。如果蜜蜂在长时间（5秒内）伸出它的长鼻（当它被给予正刺激时），但当给予负刺激时没有伸长，它被记录为正确的。如果不是，则记录为错误。每只蜜蜂都以6分钟的间隔进行三次试验。为了通过测试：蜜蜂必须在三次试验中的至少两次中正确地对正面刺激作出反应，并且不得在所有三次试验中对负面刺激作出反应。测试结束后，将经过训练的蜜蜂（通过测试的蜜蜂）和未经训练的蜜蜂（对照组）的头部用剪刀剪下，并储存在1.5ml无RNase的液氮管中。
见图3

图3.培训和保留测试流程图

数据分析

我们的实验数据已经发表在“科学报告”中（Guo et al。，2016）。培训结果见表1.

表1. PER培训结果

笔记

当蜜蜂被给予饱和盐水溶液作为负面刺激时，重要的是只让他们吃一点饱和盐水溶液。我们已经注意到，消耗大量饱和盐溶液的蜜蜂往往在训练后死亡。

食谱

1 M蔗糖溶液
342克蔗糖
1000毫升蒸馏水
饱和盐水溶液
36.5克NaCl
100毫升蒸馏水

在121°C灭菌20分钟

致谢

我们承认曹教授提供硅化合物覆盖天线。这项工作得到了中国科学院科技攻关计划（XDA01020402），国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA020402和2012AA02A202），中国农业科学研究院系统专项资金（No. CARS-45-KXJ12），国家自然科学基金（No. 31260524）和中国高等学校博士学科点专项（20123603120005）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Bitterman，M.E.，Menzel，R.，Fietz，A。和Schafer，S。（1983）。经典的蜜蜂喙伸展调理（ Apis mellifera ）。 J Comp Psychol 97（2）：107-19。
Frasnelli，E.，Anfora，G.，Trona，F.，Tessarolo，F.和Vallortigara，G.（2010）。蜜蜂嗅觉受体的形态功能不对称（ Apis mellifera ）。 Behav Brain Res 209：221-225。
国家自然科学基金面上项目资助项目，国家自然科学基金面上项目，国家自然科学基金面上项目，国家自然科学基金面上项目陈，R.（2016）。嗅觉学习期间蜜蜂脑中基因表达的横向化 Sci Rep 6：34727。
Letzkus，P.，Ribi，W.A.，Wood，J.T.，Zhu，H.，Zhang，S.W。和Srinivasan，M.V。（2006）。蜜蜂嗅觉横向化 Apis mellifera Curr Biol 16（14）：1471-1476。
Masutaro，K.（1957）。 Bildung eines bedingten Reflexes von PAVLOVs Typus bei der Honigbiene，Apis mellifica。 Sc北海道大学六年级Zool 13（1-4）：458-464。
Kandel，E.R。，Schwartz，J.H。和Jessell，T.M。（2000）。神经科学原理。麦格劳•希尔。
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