材料和摄取物

ART提示1,000μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：2079G）
ART提示200μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：2069G）
ART提示10μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：2139-RT）
5ml STRIPETTE（Corning，Costar，目录号：4487）
10ml STRIPETTE（Corning，Costar ，目录号：4488）
25ml STRIPETTE（Corning，Costar ，目录号：4489）
18 G x 1英寸一次性针（BD，目录号：305195）
30毫升BD Luer-Lok注射器（BD，目录号：302832）
猎鹰锥形管，50毫升（Corning，Falcon ，目录号：352098）
猎鹰锥形管，15毫升（Corning，Falcon ，目录号：352057）
96孔细胞培养板，圆底（Corning，Costar ，目录号：3799）
无菌聚苯乙烯培养皿100×15毫米（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
血液采集单位
XL10-Gold Ultracompetent电池（Agilent Technologies，目录号：200314）
pGEM-T载体系统I（Promega，目录号：A3600）
1x不含钙和镁的PBS（Lonza，目录号：17-516Q）
Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，目录号：17-1440-02）
台盼蓝溶液，0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
EasySep人CD8 + T细胞富集试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19053）
抗体
CD8（BioLegend，目录号：301033）
CD45RO（BioLegend，目录号：304210）
CD45RA（BioLegend，目录号：304134）
CCR7（BD，BD Biosciences，目录号：561271）
CD95（BioLegend，目录号：305622）
活死的污渍（Tonbo Biosciences，产品目录号：13-0870）
CpGenome直接制备亚硫酸氢盐修饰试剂盒（Merck，目录号：17-10451）
Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒（ZYMO RESEARCH，目录号：D4002）
S.O.C.培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：15544034）
DirectPrep 96 MiniPrep Kit（QIAGEN，目录号：27361）
甲基化特异性PCR引物（购自Integrated DNA Technologies）（见设计说明）
热灭活胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，Hyclone TM，目录号：SH30910.03）
具有L-谷氨酰胺的RPMI 1640（Mediatech，目录号：10-040-CM）
0.5M EDTA（Invitrogen，目录号：15575-038）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002-25G）
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Life Technologies，目录号：C1165）
庆大霉素（50mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15750060）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
人重组IL-7储备液，250μg/ ml（PeproTech，目录号：AF-200-07）
人重组IL-15储备液，250μg/ ml（PeproTech，目录号：AF-200-15）
10×Tris /硼酸/ EDTA（TBE），核酸电泳缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610733）
琼脂糖（Hoefer，目录号：GR140-500）
溴化乙锭10mg / ml（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15585011）
LB琼脂磨（Sigma-Aldrich，目录号：L3027-1KG）
2x LB肉汤（Teknova，目录号：L8080）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-5G）
IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758-10G）
X-gal（Lambda Biotech）
JumpStart Taq ReadyMix 2x（Sigma-Aldrich，目录号：P2893）
热灭活FBS（见食谱）
含有谷氨酰胺和4％FBS的RPMI 1640（见食谱）
富集缓冲液（见食谱）
含谷氨酰胺，4％FBS和0.02％叠氮钠的RPMI 1640（见配方）
FACS缓冲液（见食谱）
4μMCFSE工作解决方案（见食谱）
含谷氨酰胺和10％FBS的RPMI 1640（见食谱）
培养基（见食谱）
IL-7和IL-15工作解决方案（见食谱）
1倍TBE（见食谱）
2％琼脂糖凝胶（见食谱）
LB琼脂平板（见食谱）

设备

Neubauer血球计（Hausser Scientific，目录号：3200）
P1000（Gilson，目录号：F123602）
P200（Gilson，目录号：F123601）
P10（吉尔森，目录号：F144802）
水浴
37°C摇床
37°C培养箱
Sorval Legend XTR离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorval TM Legend TM XTR，目录号：75004520） >
EasySep STEMCELL Technologies 15毫升和50毫升磁铁
组织培养孵化器
生物安全柜
卧式凝胶电泳仪（Hoefer，型号：SUBHT）
真空歧管
Nikon Eclipse TS100显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TS100）
索尼生物技术SY3200分选机（Synergy）（索尼生物技术公司，型号：SY3200）
高压灭菌器（Getinge，型号：133LS）

软件

FlowJo软件（版本9.7.6）
QUMA软件（ http://quma.cdb.riken.jp/ ）

程序

分离人外周血单核细胞（PBMC）
1. 通过使用30毫升注射器和18-G 1英寸针头从采血单位收集血液。
  注意：将所有血液制品，试管和溶液分装到生物危害包中。
2. 在含有25ml 1x无钙和无镁PBS的50ml试管壁上慢慢分配10ml血液。
3. 在稳定的流动下，将稀释的血液覆盖在含有15ml Ficoll的50ml管的壁上。
4. 在400 x g的条件下旋转15分钟，不用刹车
5. 收集含有外周血单核细胞的间期，并将其转移到50ml管中。
6. 用含谷氨酰胺和4％FBS的RPMI 1640（参见食谱）以10倍体积洗涤，然后在400×g下旋转5分钟。
富集人类CD8 T细胞
1. 滗析来自步骤A6的上清液，并将细胞沉淀物重悬于富集缓冲液中进行计数（参见食谱）。
2. 取10μl细胞悬液，加入90μl台盼蓝（1:10稀释），然后用血细胞计数器计数（预期的细胞数为10 -8 -10 -9，）。
3. 计数后，制备浓度为5×10 7细胞/ ml（如果> 4.25×10 8个细胞总数的细胞悬液，然后使用50ml管;如果＆lt; ; 4.25×10 8个细胞，然后使用15毫升管）。
4. 添加浓度为50μl/ ml细胞的浓缩混合液（包含在EasySep试剂盒中），上下移液混匀，室温孵育10分钟。
5. 在孵育10分钟的过程中，将EasySep D磁性颗粒涡旋30秒，或直到观察到均匀的悬浮液。
6. 加入150μl/ ml细胞的颗粒，充分混合，室温孵育5分钟。
7. 孵育5分钟后，使用富集缓冲液（参见食谱）使细胞悬浮液的总体积为10ml，总细胞数为4.25×10 8个，或者如果> 4.25×10 8个细胞。
8. 将管放在EasySep磁铁上。
9. 5分钟后，使用移液管从50毫升管中收集阴性部分。如果使用15ml试管，则将连续运动中所需的部分倒入新的50ml试管中（类似于步骤B2）。有关协议和此步骤的更多详细信息，请访问 https ：//www.stemcell.com/easysep-human-cd8-t-cell-enrichment-kit.html 。
排序人类幼稚和记忆CD8 T细胞亚群
1. 计数后（预计细胞数为总PBMC计数的10-15％），在50ml管中用RPMI和4％FBS（直到50ml标记）洗涤细胞并以400xg < > 5分钟。
2. 倒出，重悬于FACS缓冲液中，并以100μl最终体积将细胞分配成每个FACS管50×10 6个细胞。
3. 染色CCR7抗原，然后在37℃的水浴中孵育20分钟（见上文关于荧光染料，克隆，制造商，产品目录号和稀释度的注释和材料和试剂，见表1）。
  
  表1.用于细胞分选的人抗体缀合的荧光染料的列表
  
  注意：除抗CD95 PECy7抗体1:20外，所有抗体稀释度均为1：100。最终体积是100μl。活死亡染色是在无血清pbs表面污渍之前进行的。
4. 用RPMI 4％FBS和0.02％叠氮化钠洗涤细胞（见配方和注释），然后在400×g下旋转5分钟。
5. 滗析并染色CD8，CD45RO，CD45RA，CD95和活的/死的污点，在室温下在黑暗中孵育30分钟。
6. 用FACS缓冲液洗涤细胞，然后在400×g下旋转5分钟。
7. 滗析并将所有染色的细胞集中成一个管子进行分选。
8. 根据以下表面标记对活的幼稚和记忆CD8 T细胞亚组进行分类：
  1. 幼稚的CD8 T细胞：CCR7 +，CD45RO +，CD45RA +，CD95-，+ / +
  2. Tem CD8 T细胞：CCR7 - ， CD45RO
  3. Tcm CD8 T细胞：CCR7 + / CD45RO + /
  4. Tscm CD8 T细胞：CCR7 +，CD45RO +，CD95 + + / +
用增殖追踪染料CFSE标记分选的T细胞
1. 用预热的FACS缓冲液清洗分选的细胞（见食谱），然后在400×g下旋转5分钟。
2. 在1毫升预热的FACS缓冲液中倾倒并重悬500,000个细胞。
3. 准备4μMCFSE工作解决方案（见食谱），然后添加1毫升的工作解决方案，1毫升细胞悬液，并在37°C孵育5分钟。
4. 用50ml冷RPMI和20％FBS洗涤（见食谱），然后放在冰上5分钟。
5. 在400℃旋转5分钟，4分钟
6. 重复步骤D4和D5。
7. 完全沉淀后，重悬于150μl培养基中（见食谱），并将细胞悬液转移到96孔圆底培养皿中。
8. 准备IL-7和IL-15各50 ng / ml的工作溶液（见配方），然后将150μl工作溶液加到96孔板中的150μl细胞悬液中。
9. 5％CO 2在37°C孵育。
10. 培养7天后，如图1A（Abdelsmed等人，2017）所示，对未分裂和分裂的细胞群（第三或更多）进行DNA甲基化分析。
  
  图1.代表性数据分析A.FACS图：来自一个代表性供体的CFSE稀释物显示IL-7 / IL-15体外分选的CD8T细胞亚群的增殖培养7天。每个门中的百分比表示细胞划分多于3个分区。 B.亚硫酸氢盐测序分析：每条水平线表示一个克隆，而垂直线是差异甲基化区域中不同CpG位点。空心圆表示未甲基化的CpG，而实心圆表示甲基化的CpG。这些数据和分析是已发表数据的代表（2017年，Abdelsamed等人，2017; Ghoneim等人，，2017）。
基因座特异性亚硫酸氢盐测序分析（DNA-甲基化分析）
1. 将分选的细胞裂解，并使用CpGenome直接制备亚硫酸氢盐修饰试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐处理。
2. 使用重亚硫酸盐处理的DNA作为模板以使用JumpStart ReadyMix 2x扩增特定的靶序列。甲基化特异性PCR程序如下：
  1. 95°C 5分钟
  2. 95°C 30秒
  3. 55°C 1:30分钟
  4. 去步骤B 49次
  5. 4°C无限期
3. 准备含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶（见食谱）。
4. 将凝胶倒入凝胶盘，然后等待凝胶。
5. 将PCR产物加载到凝胶中，然后使用1x TBE运行凝胶（见食谱）。
6. 剪下合适的条带，消化凝胶，然后用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit提取DNA。
7. 使用pGEM-T Vector System I试剂盒将整个PCR产物用于连接反应。
  注意：建议在4°C下过夜孵育
8. 将连接产物与50μlXL-10感受态细菌混合并置于冰上20分钟。
  注意：建议使用三分之一的连接产物进行转化，并保存在-20°C以下。
9. 在42°C孵育含有细菌/ DNA混合物的试管45秒
10. 立即放置在冰上2分钟
11. 加入400μlS.O.C。培养至每管，然后在37℃的摇床（150转）孵育90分钟。
12. 在LB琼脂平板上涂抹150μl细菌悬液（见食谱）。
13. 在37°C孵育18小时
14. 在深96孔板中，每孔接种一个白色细菌菌落，每孔含有900μl含有0.1mg / ml氨苄青霉素的LB培养基（见注）。
15. 在37°C孵育细胞培养18-22小时，摇动（220转）。
16. 旋转96孔深孔板，1600×g×15分钟
17. 滗析上清液，然后按照DirectPrep 96 Miniprep Kit中的说明从细菌沉淀中提取质粒。
18. 用60μl洗脱缓冲液洗脱DNA，将96孔板干燥过夜，然后使用300-600ng DNA进行Sanger测序，使用pUC / M13反向引物。
19. 上传Ab1测序文件作为zip文件到QUMA网站（甲基化分析定量工具， http：//quma.cdb .riken.jp / ）。
20. 通过使用QUMA网站分析数据后，其读数如图1B所示。

数据分析

使用FlowJo软件（版本9.7.6）分析流式细胞术数据（图1A），同时使用QUMA软件分析DNA甲基化数据（ http://quma.cdb.riken.jp/ ）。每个测序AB1文件代表一个克隆。简而言之，将每个克隆的所有AB1文件压缩并上载到软件中，然后将目标基因的靶序列与测序的克隆进行比对。软件读数显示在图1B中。

笔记

甲基化的胞嘧啶被保护免于脱氨基反应，而非甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶。使用Sanger测序，这种单核苷酸分辨方法检测甲基化胞嘧啶作为胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶作为胸腺嘧啶。要了解有关亚硫酸氢盐转化的更多信息，请访问Zymo Research网站（ www.zymoresearch.com/epigentics ）。< br />
甲基化特异性PCR程序中使用的引物应具有以下条件：
1. 不包含任何CpG网站
2. 退火温度：56-60°C
3. 长度：26-30 bp
4. 所有的胞嘧啶都应该转化为胸腺嘧啶。在正向引物的情况下，在反向引物的情况下，所有的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶;所有的胞嘧啶被转换成胸腺嘧啶，然后被反向补充。
因为抗CD95抗体可以诱导细胞凋亡，所以建议将叠氮钠添加到染色缓冲液中。
CCR7是通过细胞膜循环的趋化因子受体。
在37°C培养可以提高检测效果
要获得有代表性的数据，你需要接种每个琼脂板16-24细菌菌落，代表一个给定的条件。

食谱

热灭活的FBS
在56°C的水浴中孵育一瓶FBS 30分钟，然后准备50毫升等分试样，并储存在-20°C。
含谷氨酰胺和4％FBS的RPMI 1640
加入40ml热灭活的FBS到含有谷氨酰胺的1L RPMI中
富集缓冲液
添加10毫升热灭活的FBS到500毫升1x PBS没有钙和镁+ 1毫升EDTA（0.5 M EDTA）
含有谷氨酰胺，4％FBS和0.02％叠氮钠的RPMI 1640
添加40毫升热灭活的FBS到1升RPMI与谷氨酰胺+ 0.2克叠氮化钠
FACS缓冲区
添加20毫升热灭活FBS到500毫升1x PBS没有钙和镁
4μMCFSE工作解决方案

加入1.5μlCFSE（44.8 mM或25 mg / ml）至10 ml温热PBS
含谷氨酰胺和20％FBS的RPMI 1640
加入100ml热灭活的FBS到含有谷氨酰胺的1L RPMI中
培养基
在含谷氨酰胺的1升RPMI中，加入以下物质：
100毫升热灭活FBS
1毫升庆大霉素（1：1,000稀释）
10 ml青霉素 - 链霉素（1：100稀释）
IL-7和IL-15工作解决方案
1. 将1微升250微克/毫升IL-7和1微升250微克/毫升IL-15加入到2.5毫升的培养基中
2. 以1：1的比例稀释到培养基中，然后直接使用150μl，加入150μlCFSE标记的细胞接种于96孔板中。
1x TBE
使用去离子水稀释10倍TBE至1倍TBE
2％琼脂糖凝胶
1. 加2克琼脂糖LE到100毫升的1×TBE，然后加热微波直到凝胶完全溶解
2. 加入5μl溴化乙锭（10mg / ml）以达到5ng / ml的最终浓度
3. 充分混合，然后倒入凝胶盘
LB琼脂平板
1. 将40克LB琼脂溶解在1升双蒸水中，然后高压灭菌器中
2. 将温度降至45°C，然后加入100 mg氨苄青霉素，230 mg IPTG和100μlX-gal
3. 充分混合，倒入无菌培养皿15毫升，并在生物安全柜
  下开放
4. 等到琼脂平板凝固，然后在4°C储存长达一个月

致谢

我们感谢Angela McArthur博士的科学编辑。这项工作得到了美国国立卫生研究院资助1R01AI114442和ALSAC（致B.Y.）的支持。作者声明没有竞争的财务利益。该方案已经从Lugli等人的2013年 - 识别，分离和体外扩增人和非人灵长类动物T干细胞记忆细胞中进行了修改和修改。 Nat Protoc 8（1）：33-42。

参考

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Gattinoni，L.，Lugli，E.，Ji，Y.，Pos，Z.，Paulos，CM，Quigley，MF，Almeida，JR，Gostick，E.，Yu，Z.，Carpenito，C.，Wang，E 。，Douek，DC，Price，DA，June，CH，Marincola，FM，Roederer，M。和Restifo，NP（2011）。具有干细胞特性的人类记忆T细胞亚群 Nat Med 17（10）：1290-1297。
Ghoneim，HE，Fan，Y.，Moustaki，A.，Abdelsamed，HA，Dash，P.，Dogra，P.，Carter，R.，Awad，W.，Neale，G.，Thomas，PG和Youngblood，B （2017）。重新表观遗传程序抑制PD-1阻断介导的T细胞再生。 > Cell 170（1）：142-157 e119。
Lugli，E.，Gattinoni，L.，Roberto，A.，Mavilio，D.，Price，D.A.，Restifo，N.P.and Roederer，M.（2013）。人类和非人类灵长类动物T的鉴定，分离和体外扩增细胞记忆细胞。 Nat Protoc 8（1）：33-42。
Masopust，D.，Vezys，V.，Marzo，A.L。和Lefrancois，L.（2001）。在非淋巴组织中优先定位效应记忆细胞科学 > 291（5512）：2413-2417。
Plotkin，S.A.，Orenstein，W.A。和Offit，P.A。（2013）。疫苗。（第6版）。
Sallusto，F.，Lenig，D.，Forster，R.，Lipp，M。和Lanzavecchia，A。（1999）。具有不同寻靶潜能和效应功能的两种记忆T淋巴细胞亚群自然 401（6754）：708-712。