材料和试剂

个人防护设备（手套，实验服，眼睛保护）
组织培养皿，150×25毫米（Corning，目录号：430599）
50毫升锥形管（Corning，目录号：431472）
组织培养皿，6孔（Corning，目录号：3516）
9“一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
Fisherfinest TM高级覆盖玻璃（50 x 35 mm）（Fisher Scientific，目录号：12-548-5R）
玻璃针，单毛细管，1.2毫米×4英寸（102毫米）（世界精密仪器公司，产品目录号：1B120F4）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
Beckman Ultra-Clear超速离心管（Beckman Coulter，目录号：344058）
Eppendorf Microloader TM20μl移液枪头（Eppendorf，目录号：930001007）
1.5毫升管（VWR，目录号：20170-333）
96孔板（康宁，目录号：3915）
造型粘土（Nasco，目录号：0300257M）
℃。线虫 N2株（Caenorhabditis遗传中心）
编码荧光标记基因[例如，VSV-dsRED（Duntsch等人，2004）]和/或萤火虫荧光素酶[例如的重组的水泡性口炎病毒>，VSV-LUC（Cureton等人，2009）]
细菌大肠杆菌（Escherichia coli）菌株OP50（Caenorhabditis遗传中心）
幼仓鼠肾（BHK-21）细胞系（ATCC，目录号：CCL-10）
Vero细胞系（ATCC，目录号：CCL-81）或BSC-40细胞系（ATCC，目录号：CRL-2761）
甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：19-2930）
结晶紫染色液（山田和高冈，2017）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C6158）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP160-500）
微注射油（系列700卤烃油）（Sigma-Aldrich，目录号：H8898）
报告人裂解缓冲液5x（Promega，目录号：E3971）
萤光素酶测定试剂（Promega，目录号：E1483）
6.0％次氯酸钠溶液（Fisher Scientific，目录号：SS290）
氢氧化钾颗粒（KOH）（Fisher Scientific，目录号：P250）
达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6429）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S12450）
100x（Sigma-Aldrich，目录编号：A5955）抗生素 - 抗真菌溶液
L-谷氨酰胺，100x（Mediatech，目录号：25-005-CI）
MEM非必需氨基酸（Mediatech，目录号：25-025-CI）
NGM板（何，2011a）
5-氟脱氧尿苷（FUdR）（Sigma-Aldrich，目录号：F0503）
50％（w / v）聚乙二醇（PEG）3000（Rigaku Reagents，目录号：1008056）
M9缓冲区（他，2011a）
乙酸（Fisher Scientific，目录号：A38）
甲醇（PHARMCO-AAPER，目录号：339000000）
甲醛（Fisher Scientific，目录号：BP531-500）
固定解决方案（山田和高冈，2017）
漂白解决方案（见食谱）
完整的DMEM（见食谱）
NGM + [50μg/ ml] FUdR平板（见食谱）
M-PEG（见食谱）

设备

具有5％CO 2（Eppendorf，型号：Galaxy 170S）的37℃细胞培养箱。
2型生物安全柜（NuAire，型号：NU-425-400）
台式离心机（例如Eppendorf，型号：5810 R）的摇摆式离心机能够容纳50ml锥形管（Eppendorf，型号：A-4-62 ）
用Beckman SW28转子（Beckman Coulter，型号：SW 28 Ti）超速离心（例如Beckman Coulter，型号：Optima TM LE-80K）
冷冻的微量离心机（例如，西南科学，型号：SC1024-R）
50℃水浴（，例如，VWR，型号：89501-468）
80°C烤箱（Gruenberg，型号：CG45V240SS）
带3毫米白金板（NARISHIGE，产品目录号：PN-3H）的针式拔毛器（NARISHIGE，产品目录号：PN-30）
解剖立体显微镜（，尼康公司，型号：SMZ745）
能够保持15℃的冷藏培养箱（Sheldon Manufacturing，Shel Lab，型号：SRI20）
能保持25℃的培养箱（Sheldon Manufacturing，型号：Model 2005）
带有dsRED和GFP滤光片的荧光立体变焦显微镜（例如，ZEISS，型号：Axio Zoom.V16）
-80°C冷冻机（VWR，型号：VWR40086A）
Bioruptor IIⅡ型（Cosmo Bio，型号：Bioruptor2 12型，目录号：TOS-BR2012A）
Envision 2102 Multilabel Reader（PerkinElmer，产品目录号：2105-0010）
用于蜗杆捡拾的铂丝，30号直径0.254毫米直径（Genesee Scientific，目录号：59-30P6）
虫柄（Genesee Scientific，目录号：59-AWP）
高压灭菌器（，例如，Getinge，型号：633LS）
空气表（，例如，动力系统，型号：VIBRAPLANE）
（例如，Airgas，型号：CGA-580，目录号：NI-NF300）
压缩氮气罐（用于连接气台和显微注射器）
微量注射器单元（例如Eppendorf，型号：FemtoJet 5247）
倒置显微镜（，卡尔蔡司，型号：Axiovert 200）
微操纵器（例如，Eppendorf，型号：PatchMan 5173）
微操纵器控制器（例如，Eppendorf，型号：5171）

软件

用于Envision 2102 Multilabel Reader（版本1.12）的Wallac EnVision Manager软件
GraphPad Prism（v.6.0c，GraphPad Software Inc.）

程序

制备水泡性口炎病毒（VSV）的股票
注意：VSV是生物安全级别2（BSL-2）的病原体，因此应该使用适当的个人防护设备（手套，实验室涂层，眼睛防护）来处理。可以使用70％乙醇或10％漂白剂溶液使病毒失活并对设备进行去污染。因此，在用适当的生物危害废物容器通过高压灭菌进一步净化之前，将10％漂白剂中暴露于病毒的塑料器皿，介质和针浸泡至少30分钟是非常重要的。
1. 将种子〜5×10 6 BHK细胞/皿放入四个150×25mm的组织培养皿中。让细胞连接过夜，这将导致第二天达到80-90％融合的培养皿（图1）。
  注意：汇合可以影响VSV效价，当细胞覆盖板表面的80-90％时，启动感染的最佳汇合是
2. 第二天，将稀释的发酵剂VSV原液加入具有适当体积（取决于起始原液滴度）的20ml DMEM中，使用5ml该感染的VSV-DMEM混合物/感染皿，获得0.01的感染复数（MOI）。例如，假设细胞倍增时间为约24小时（产生总细胞数为1×10 7个/皿），则每个细胞需要1×10 5 PFU每个培养皿感染5ml的DMEM。
3. 在37℃下用5％CO 2 2℃孵育细胞2小时，每30分钟摇动以将接种物均匀地散布在培养皿上。
4. 感染后2小时（hpi）用25毫升完整的DMEM代替接种菌（见食谱）。
5. 在24-36hpi后，当观察到显着的细胞病变效应时，约50％的细胞单层已经从平板上脱落并且细胞在外观上变得圆润（图1），从感染的培养物中收集上清液并置于50ml圆锥形管。
  
  图1.在（A和C）和VSV感染（B和D）〜30小时之前的BHK细胞培养
6. 在具有摆动斗式转子的台式离心机中，在4℃下将收获的上清液在1,000×gg下离心10分钟以沉淀细胞。
7. 将等体积的澄清上清液（〜25毫升/每个）转移到Beckman Ultra-Clear超速离心管中，并将管置于SW28摆动桶转子中。
8. 通过在4℃以25,000rpm（〜50,000×gg）超速离心2小时来沉淀病毒颗粒。
  超速离心后，应在每个管底部观察颗粒
9. 吸出上清液，并在0.5毫升或更少的DMEM中重悬病毒颗粒。
10. 将10μl浓缩的VSV原液分装到冷冻管中并在-80℃下冷冻。
  注意：冻结多个小的VSV等份是很重要的，因为在多次冻融循环之后病毒滴度迅速降低，因此每个试管应该解冻一次。
11. 为了测定所得VSV原液中斑块形成单位（PFU）/ ml的数量，在Vero（或BSC-40）细胞的6孔培养皿中使用10倍系列稀释和噬菌斑测定对浓缩的原液滴定（Yamada和高冈，2017）。简言之，将约5×10 6个Vero细胞接种在6孔培养皿中，使其汇合，然后感染2小时，连续稀释VSV储存液（通常在10℃） 10 -5 -10 -5），并用2ml含有2.4％甲基纤维素的完全DMEM覆盖24小时。然后使用固定溶液（Yamada和Takaoka，2017）将细胞甲醛固定，去除覆盖的培养基，并用结晶紫染色观察噬斑。有关斑块分析的更多细节和配方，请参阅山田和2017年高冈。
  注意：通常用这种方法获得〜1×10 10 PFU / ml的VSV滴度。 />
琼脂糖垫的制备
1. 煮沸2％琼脂糖水溶液，置于50°C水浴中。
2. 使用巴斯德移液器将一滴热琼脂糖转移到大盖玻片的中间，然后立即将第二片盖玻片以90°角放到琼脂糖滴上的第一片盖玻片上。
3. 一旦琼脂糖固化，将盖玻片分开。将盖玻片在80°C的烤箱中放置一个小时，以干燥垫。
  注：见Pastuhov等。（2017），演示如何制作琼脂糖垫。
准备针头
注意：下面的程序描述了我们的制备显微注射针和注射程序本身的方法。有关微注射的更多详情，请参阅Evans，2006。
1. 使用PN-30拔针器中的玻璃毛细管拉针注意：确定拉针的正确设置需要反复试验，因为毛细管直径，长丝尺寸和方向的变化会改变针的质量。好的针头应该很容易地刺破蠕虫而不杀死它们。
2. 使用凹槽作为导向将毛细管滑过灯丝环，注意不要打扰灯丝本身。
3. 定位灯管，使灯丝一半向下，然后拧紧灯丝两侧的旋钮，将毛细管固定到位（图2A）。
  
  图2.显微注射针的制备：一种。毛细管在PN-30拔针器中的定位; B.拔针后得到的针头; C.在微量注射仪上进行破拉针的设置; D.在断裂之前将针定位在盖玻璃边缘旁边; E.将针弯曲到玻璃盖边缘以形成开口; F.通过气泡形成确认针头开口。
  注意：D-F中的图像是放大40倍的视野。
4. 盖上盖子，然后按开始按钮。
  。毛细管的拉动将导致尖端的针头（图2B）
5. 针头已关闭，因此使用前需要断开。像注射蠕虫一样将针头装入显微注射装置（图2C）。
6. 小心地用玻璃布或纸巾包住盖玻片，轻轻弯曲玻璃直至其破裂。理想情况下，打破一个50毫米的盖玻片4-6片。
7. 用一滴微量注射油将碎片盖在第二片盖玻片上，以保持碎片位置（图2C）。
8. 将盖玻片放在舞台上，并使用5x物镜将玻璃片的边缘对焦。
9. 将针头对准玻璃碎片边缘并切换到40x物镜（图2D）。
10. 如有必要，重新对焦，然后轻轻将针头推向玻璃碎片的侧面。一旦针尖稍微弯曲（图2E）并在玻璃上振动，将其拉出并将少量空气注入油中。气泡确认尖端已被打开（图2F）。
试验动物的制备
1. 如（He，2011b）所述，使用漂白溶液（参见食谱）在L1阶段同步蠕虫（N2和测试动物）。
2. 分配大约50到100个L1蠕虫/基因型，以测试包含OP50细菌的35mm NGM板。
3. 蠕虫生长到年轻的成年阶段。
  注意：
  1. 确定最佳生长条件，包括温度，以确保不同遗传背景的蠕虫在注射当天到达年轻成年阶段。我们建议将多个盘子用蠕虫接种，并将盘子保持在多个温度[例如，15℃，室温（RT），25℃]，因为突变动物可能以不同的速率发育。我们建议在15°C下大约96小时，或在室温下大约48小时，以产生年轻人。
  2. 除了N2动物之外，还建议在VSV中加入一种超敏感的突变体，如drh-1突变体（Gammon et al。，2017），这种突变体具有缺陷的抗病毒RNAi反应（Gammon et al。，2017）将测试动物与两种极端感染进行比较。
用注射混合物制备针头
1. 在一个150 x 25毫米的培养皿中放置一条造型粘土带以保持针头。
2. 在冰上解冻10μl1×10 8 PFU / ml VSV-dsRED或VSV-LUC，然后与90μlDMEM混合。基于约10nl /蠕虫的估计注射体积（使用分别为30psi和2秒的毫微微喷射注射压力和时间设定），该注射混合物导致〜10 4 PFU /动物。
  注意：较低的剂量（10 2 -10 3 3 PFU）也可以建立感染，尽管感染率是剂量依赖性的（Gammon等，2017）。
3. 在4℃下将注射混合物在5,000xg下离心10分钟以沉淀任何可能堵塞针头的颗粒。将20μl上清液转移至新的1.5ml管中用作注射介质。
  注：缺乏VSV的DMEM用于模拟感染培养基，作为感染的阴性对照。
4. 用水轻轻浸泡Kimwipe，将其折叠成条状，并将其粘贴在持针培养皿的内部以保持湿度。
5. 使用microloader提示加载2μL注射媒体（或DMEM模拟感染）到4-6针。将每个装入的针头放入针头盒中。图3显示了持针器的设置示例。
  注意：为了去除针头中的气泡，让它们垂直放置（针尖朝下）几分钟，让重力消除气泡。如果气泡仍然存在，轻轻敲击针的侧面，以搅动气泡逸出。
  
  图3.针头固定器将针头牢固地放置在150 x 25 mm培养皿内的造型粘土上，该培养皿中还包含一个湿润的Kimwipe以保持湿度。
显微注射病毒媒介
注意：由于显微注射是需要时间来掌握的程序，我们建议通过注射蠕虫与无病毒DMEM并且确保注射蠕虫绝大多数（> 80％）在第二天存活，然后继续VSV注射。
1. 在微量注射油中浸入移液器尖端，并在盖玻片的琼脂糖垫上涂抹非常薄的油层。
  注意：如果油层太厚，蠕虫会保持活动自由，需要花费额外的时间仔细压下蜗杆，使其沉降并粘在琼脂糖注射垫上。一旦蠕虫在垫上，它会开始干燥，如果时间太长，将无法生存。
2. 将准备好的针头装入持针器，并将其安装在机械手上，如图2C所示。
3. 在一个解剖立体镜上，用蠕虫把一个蠕虫从它们的NGM板转移到琼脂糖垫上。
  注意：要方便地进行操作，首先触摸微量注射油，然后使用机油来帮助拿起你的锄头。尽量减少细菌从平板转移到垫。
4. 使用镐轻轻地将蠕虫全部排成一排，所有的蠕虫都朝向相同的方向。
5. 将幻灯片转移到显微注射的范围，并使用5x物镜集中蠕虫。提高焦点的水平略高于蠕虫，然后使用操纵器来定位针，直到它的尖端对焦，正确的蠕虫之上。
6. 切换到40倍的目标，重新集中在蠕虫，然后降低针进入视野。针尖应位于蜗杆旁边，蜗杆最宽的焦平面上。
7. 目的是将针头插入咽喉末端球管的后面，以便将病毒注入体细胞（而不是生殖腺）组织（图4）。针应该以一个小角度（15°到40°）插入，以使其进入。
  
  图4.显微注射部位的示范
8. 注射蠕虫使用femtojet注射压力和时间设置30 psi和2秒
9. 注射后，快速将盖玻片转移回立体镜。吸取5μL的M-PEG（见食谱）直接在油中的蠕虫。蠕虫会从琼脂糖中解脱出来，在M-PEG中游泳。一旦所有的蠕虫都是免费的，吸取包含蠕虫的M-PEG，然后将蠕虫移液到含有氟脱氧尿苷（FUdR）的NGM板上（参见食谱）。
  注意：
  1. FUdR干扰DNA复制并防止卵和早期幼虫的发育，并且因此允许在几天内追踪注射的动物而不受蠕虫后代的干扰。
  2. 每个FUdR板应该有30-40个注射蠕虫。
10. 一旦进行了所有的注射，将所有FUdR平板置于15-25℃的培养箱中。
  注意：感染的线虫的病毒复制和寿命通过在较低的温度下培养温度而显着改变，通常导致感染的蠕虫更少并且存活更大（Gammon等，2017）。我们通常在25°C孵育感染的蠕虫以达到更高的病毒复制速度（Gammon等，2017）。
使用荧光分析评估感染（注射VSV-dsRED后）
注意：注射无病毒DMEM的蠕虫在本实验中作为感染的阴性对照组。这些动物可以用于确保在VSV-dsRED注射的动物中观察到的荧光不是人为的。
1. 蠕虫对铂金蠕虫轻轻触摸反应迟钝被认为是死的，并从实验中删除。所有在18hpi内死亡的动物都被认为没有从显微注射过程中恢复，并且从实验中移除。在实验过程中爬出盘子并丢失的动物也受到审查。
  24小时后开始对其余蠕虫进行评分
2. 使用荧光立体显微镜，每24小时对dsRED信号进行评分，并记录下仍存活的动物数量，去除死亡的动物。
  注意：N2蠕虫通常会在头部，外阴和尾部的肌肉组织中出现dsRED信号（图5）。然而，注射过敏的蠕虫，如drh-1突变体，将在整个身体的多个组织中显示dsRED信号（图5）。当对具有明显的荧光信号的蠕虫进行评分时，总是检查GFP通道，以确保信号不是肠道自发荧光，并且该信号是特定于dsRED通道的。而且，仅用DMEM注射的阴性对照组应该不存在dsRED信号。任何与对照动物中观察到的背景自发荧光明显不同的具有dsRED信号的动物（在任何组织中）记为感染阳性。显示具有不同VSV敏感性的动物可以使用发光分析进一步测试（见下文）。
  
  图5.用VSV-dsRED 72hpi感染的N 2和em-drh-1动物的微分干涉对比（DIC）和荧光显微照片。绿色荧光指示肠中的自体荧光信号。
  另见2017年金门等人
用发光试验评分感染（注射VSV-LUC后）
注意：在本实验中，注射无病毒DMEM的蠕虫可作为感染的阴性对照组
1. 在感染后的特定时间间隔（通常为24-72hpi），应从每次处理中收获虫，以评价荧光素酶活性，其用作VSV-LUC复制的读数（Gammon等人，2014年和2017年）。
2. 在每个选择的时间点，在100μl报告分子缓冲液（一式三份）中为每个菌株挑选10个蠕虫。
3. 在-80°C冰箱或液氮中快速冷冻，在室温下解冻，用Bioruptor II超声仪（30秒高温）超声处理，再次冻结，再次在室温下解冻。
4. 将20μl裂解物定位到96孔培养皿中，并用100μl萤光素酶测定试剂混合每个孔。
5. 使用Envision 2102 Multilabel Reader和Wallac EnVision Manager软件测量任意光照单位（LU）。
  注意：注射无病毒DMEM（对照组）的蠕虫的裂解液可以用于确定背景LU信号，以从由VSV-LUC激发的动物的裂解物获得的LU信号中减去这些值的平均值。

数据分析

荧光分析
1. 使用（〜30-40个注射的蠕虫/实验）进行至少三次独立实验后，使用GraphPad Prism软件绘制随时间推移评分为感染（dsRED阳性）的动物的平均百分比（例如，参见图6A）。未配对的学生的测试可以用于比较两个菌株（例如，N 2与drh-1）之间的最大感染率（Gammon等人。，2017）。
  注：根据蠕虫的基因型，并非所有注射都能导致可观察到的（例如dsRED阳性）感染，但注射后dsRED阳性动物的频率差异可能是有意义的，因为它可以表明不同的易感性感染（例如，比较图6A中的N2和drh-1感染率）。此外，通过绘制每个基因型达到最大感染率的时间（例如，在图6A中：N2 = 72hpi，drh-1 = 48hpi），还可以观察到更敏感的菌株比N2菌株更早地达到该最大值。这些数据可以帮助鉴定VSV易感性改变的遗传背景。
2. 使用GraphPad Prism软件绘制随时间推移存活的动物的百分比（例如参见图6B）以估计动物的寿命（从显微注射到死亡）。
  
  图6.显示感染（dsRED阳性）随时间的变化（A）的线虫百分比（n = 30 /组）和线虫感染103 PFU的VSV-dsRED后的存活（B）的实例数据
3. 如果需要的话，使用存活曲线的非线性回归分析来计算50％的动物已经死亡的时间或“致死时间50”和它们的95％置信区间（Gammon等人，2017）。具有95％置信区间不重叠的治疗被认为具有显着不同的寿命。或者，可以使用GraphPad Prism软件来构建Kaplan-Meier存活曲线，并将其与logrank测试（或Wilcoxon-Gehan-Breslow测试）进行比较。
萤光素酶测定
1. 在进行至少三次独立实验后，使用GraphPad Prism软件绘制每个时间点从每个感染组恢复的平均LU（例如参见图7）。
2. 如果需要，可以使用不配对的Student's test实验来比较两个不同菌株在每个时间点获得的平均LU（Gammon等人，2017）。
  
  图7.显示感染后指定时间从感染了10 4 PFU的VSV-LUC的线虫裂解物获得的光单位（LU）的实例数据。这些数据证明，与感染的N2蠕虫相比，使用从VSV-LUC感染的drh-1动物制备的裂解物在LUC测定中通常观察到升高的LU信号。数据代表三个独立实验的手段，误差线代表标准误。

食谱

漂白解决方案
60毫升6.0％次氯酸钠溶液
30毫升5 N KOH
410毫升ddH 2 O
结合并在4°C储存
完成DMEM
500毫升DMEM
50毫升FBS
5毫升抗生素 - 抗真菌剂
5毫升L-谷氨酰胺，100x
5毫升MEM非必需氨基酸
NGM + [50μg/ ml] FUdR平板
按照（He，2011a）所述制备NGM琼脂溶液，并在浇注之前添加50μg/ ml的FUdR。在4°C储存板块
M-PEG（100毫升）
0.1毫升0.1％PEG 3000
100毫升M9缓冲液
结合并在4°C储存

致谢

该协议是从Gammon等人改编的，2017年。DG得到了得克萨斯大学西南医学中心捐赠的学者计划的资助。 RL得到了美国国立卫生研究院的资助（GM84198资助）。作者感谢Drs。田纳西大学健康科学中心的Michael Whitt和哈佛医学院的Sean Whelan提供了VSV-dsRED和VSV-LUC。作者声明不存在冲突或利益冲突。

参考

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