材料和试剂

显微镜载玻片和盖玻片（购自Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：MNJ-400-030Y和MNJ-100-030J）
注：幻灯片和盖玻片的质量是至关重要的，上述产品确实工作，如果其他人被使用，建议测试这些。
二氧化硅珠（5微米硅珠）（Bangs Laboratories，目录号：SS06N）
0.5 ml和1.5 ml微量离心管，0.2 ml PCR管
T175烧瓶（每个175cm2）（Corning BV Life Sciences，荷兰阿姆斯特丹）
10毫升血清移液器
PD-10脱盐柱（GE Healthcare，英国白金汉郡）
野生型HEK293细胞
稳定表达CFP / YFP-GalT的HEK293细胞
水
注：分子生物学级别的水用于所有程序，包括显微镜载玻片和盖玻片的洗涤。
洗涤剂decon90（Decon Laboratories Limited，Sussex，UK）
氯化钾（KCl）
遗传霉素（Gibco TM）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，高葡萄糖，丙酮酸，无谷氨酰胺）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21969）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：12657029）
GlutaMAX-I（用于L-谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代物）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：A12860-01）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml; 100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，产品目录号：15140122）
Ham's F-12营养素混合物（Sigma-Aldrich，目录号：N4888）
液氮
Tris
Optiprep密度梯度介质（Axis-Shield PoC）（Cosmo Bio，目录号：AXS-1114542）
α-HA抗体（单克隆抗HA.11）（BioLegend，目录号：901513）
二硫苏糖醇（DTT）
高尔基膜，囊泡，胞质溶胶（参见配方下工作等分试样的制备）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S / 8600/60）
HEPES
肌酸磷酸激酶
GTP
ATP
磷酸肌酸
氢氧化钾（KOH）
醋酸镁（Mg（OAc）2）
氯化镁（MgCl 2）
胰蛋白酶，2.5％（10x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15090046）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010023）
缓冲区（见食谱）
1. 分析蔗糖
2. ATP / GTP混合物（10x）
3. Cytosol缓冲液
4. HM缓冲区
5. KHM缓冲区
6. 反应缓冲液（10x）
7. 胰蛋白酶-PBS缓冲液

注意：所有的试剂和缓冲液都应该储存在-80°C的方便大小的等分试样中。当在关键的等分试样（膜，胞质溶胶，ATP / GTP混合物）上运行时，准备一套新的装置并对照旧装置进行测试，以确保重现性。

设备

微波炉
水浴
超声波水浴（格兰特仪器，型号：XUBA3）
孵化器
1毫升Dounce匀浆器（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：357538）
离心机
超速离心机
SW41转子（型号：SW 41 Ti）和13.2 ml薄壁超清晰TM < （Beckman Coulter，目录号：344059）
糖折射计（范围0-50％）（英国贝灵汉和斯坦利有限公司）
TLA 100.3转子（Beckman Coulter，型号：TLA-100.3）和3.5ml厚壁聚碳酸酯管（Beckman Coulter，目录号码：349622）
TLS-55转子（型号：TLS-55）和2.2毫升薄壁超清晰 TM管（Beckman Coulter，目录号：347356）
标准的哺乳动物细胞培养仪器
进化512 EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）相机（Photometrics，型号：Evolve 512）
蔡司Axiovert 200M全电动倒置显微镜（卡尔蔡司，型号：Axiovert 200M）
X-Cite 120Q激发光源（Excelitas Technologies，型号：X-Cite 120Q）
CFP过滤器（Chroma Technology，目录号：49001）
YFP过滤器（Chroma Technology，目录号：49003）
物镜（Zeiss Plan-Apochromat 63x / 1.40 Oil DIC，Carl Zeiss Ltd，剑桥，英国）
在成像过程中使用黑卡排除样品中的房间光线

软件

ZEN 2009软件（ www.zeiss.com ）
PM Capture Pro软件（ http://www.photometrics.com ）
AutoHotkey（ www.autohotkey.com ）（AutoHotkey Foundation LLC）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

实验准备
1. 水
  注：分子生物学级别的水用于所有程序，包括显微镜载玻片和盖玻片的洗涤。
2. 显微镜幻灯片和盖玻片
  1. 为了将载玻片和盖玻片完全浸没在其架子中，将足够的水在微波中加热至约40℃，然后将洗涤剂decon90（Decon Laboratories Limited，Sussex，UK）加入到3％ v）中。在他们的衣架上，载玻片和盖玻片在洗涤剂溶液中上下倾斜10次以帮助清除表面污染物，然后浸泡约7小时。
  2. 再浸5次，将溶液弃去，用水冲洗玻璃器皿一次，如下：将足够的水加入到容器中以完全浸没玻璃器皿，然后上下浸渍10次。将新鲜的3％（v / v）decon90溶液制成，并将玻璃器皿浸泡在其中至少12小时。然后将玻璃器皿在水中至少彻底冲洗5次，然后放入60℃的烘箱中直至干燥。一旦干燥，幻灯片和盖玻片存放在有盖的箱子，以防止灰尘污染。
3. 硅胶珠
  1. 在安装之前，制备含有5微米二氧化硅珠的悬浮液以添加到测定混合物中。珠子作为幻灯片和盖玻片之间的间隔。将少量珠粒粉末（~5μl干体积）沉积在1.5毫升微量离心管中，向其中加入500μl150mM KCl，10mM HEPES，pH7.2。
  2. 通过剧烈涡旋将珠分散在该缓冲液中，接着在超声水浴（功率35W，强度44kHz）中进行30秒的搅拌 - 重复一次以使珠变为单分散。珠密度需要使得当将3μl的混合物安装并在63×物镜下观察时，将各1μl的该悬浮液加入到25μL的测定混合物中将提供每个视野~1-2个珠子。因此，当制备新的珠子储备物时，通过将1μl的储备物与25μL水混合并且如下所述安装3μL该悬浮液并在显微镜下观察来测试珠子密度。如果珠的数量太低，珠悬浮液短暂旋转下来，并且重新悬浮时除去足够的缓冲液以增加珠密度。
    更多的缓冲液可以被添加到珠子股票相反的效果
4. 哺乳动物细胞培养
  使用稳定表达GalT的-XFP构建体的野生型和HEK293细胞克隆（科塔姆等人，2014）。这些是通过用CFP或YFP标记稳定转染含有人β-1,4-半乳糖基转移酶1的PCR3如果发现表达的GalT-XFP只在高尔基体中定位，而不是部分分布在胞质泪点中，选择单细胞来源的克隆使用。将细胞在补充有10％胎牛血清（FBS），2mM GlutaMAX-I和100U青霉素和100μg链霉素/ ml的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中培养。尽管CHO细胞系需要添加5％FBS的Ham's F12培养基和与HEK细胞培养物相同的抗生素组合物，但大多数其他细胞系在相同培养基中培养。所有的细胞系在37℃和5％CO 2下在潮湿的培养箱中生长。
5. 高尔基膜
  1. 以下方法改编自Balch等人（1984）。通常，将两个稳定表达GalT-CFP HEK细胞（Cottam等人，2014）的T175烧瓶（每个175cm 2）培养至融合单层（〜7总共约10×10 7个细胞），收获，并在0.25M蔗糖，10mM HEPES，pH 7.4中洗涤两次。使用相同的0.25M蔗糖缓冲液将细胞沉淀物（〜500-600μl）重悬于沉淀物体积的四倍。在1ml紧密装配的Dounce匀浆器中用25次冲击处理悬浮液。将匀浆在液氮中快速冷冻，然后储存在-80℃下进行亚细胞分级分离。
  2. 高尔基体膜通过在不连续的蔗糖梯度上通过离心漂浮从匀浆分离。冷冻的匀浆物在37℃快速解冻，然后保持在冰上。将匀浆体积为1.28倍的冰冷的2.3M蔗糖，10mM HEPES，pH7.4的匀浆物的蔗糖浓度调节至1.4M，通过用10ml血清移液管移液充分混合。
  3. 将该混合物装入SW41管形成底层，然后用4.94ml 1.2M蔗糖，10mM HEPES，pH7.4覆盖。然后用足够的0.8M蔗糖，10mM HEPES（pH7.4）覆盖这两层以将管填充至其最大容量为12ml（取决于底层的体积在2.5ml和3ml之间）。然后将该梯度在SW41转子中以39,000rpm，4℃离心80分钟。在冷室中，通过从梯度的顶部向下手动移液，将1.2 / 0.8M蔗糖界面处的浑浊带以最小体积（〜700-800μl）抽出。将该部分充分混合，在PCR管中等分成20μl体积，并在液氮中快速冷冻。使用0-50％糖折射计（Bellingham and Stanley Ltd，UK）测量最终样品的蔗糖浓度。蔗糖浓度总是非常接近并略高于1 M.
  4. 在该测定中，以上述方式分离的1微升高尔基体通过EMCCD成像给每个视野〜32个粒子。
6. 囊泡
  1. 以下方法改编自Love等人（1998）。通常，将稳定表达GalT-YFP HEK细胞的四个T175烧瓶生长至汇合单层（总共〜14-20×10 7个细胞），收获，并在PBS中洗涤一次，然后在0.2M蔗糖，10mM Tris，pH7.2。使用相同的0.2M蔗糖缓冲液将沉淀（〜1ml）重悬浮于沉淀体积的四倍中，在液氮中快速冷冻，然后储存于-80℃直至需要。
  2. 在Optiprep密度梯度介质的不连续梯度上通过离心浮选分离囊泡膜。冷冻的细胞悬浮液在21℃的水浴中逐渐解冻。这导致细胞通过膜破裂的透化。
  3. 将细胞在1,000℃×g，4℃下离心5分钟，使囊泡留在上清液中。将该上清液在1000×g，4℃下再次离心5分钟，然后在20000×g，4℃下再次离心2分钟，以除去所有的碎片和大的细胞膜。然后通过TLA 100.3转子在4℃以55,000rpm超速离心45分钟沉淀上清液中的囊泡。将囊泡沉淀物（通常约30μl）重悬于KHM缓冲液（参见食谱）至320μl体积。将320μl与480μl50％Optiprep在HM缓冲液中混合（见食谱）。将混合物转移至TLS-55管中并用800μl25％Optiprep在KHM缓冲液中覆盖，然后用400μl10％Optiprep在KHM缓冲液中覆盖。
  4. 通过在TLS-55转子中于4℃以55,000rpm超速离心3小时10分钟使囊泡漂浮至10％/ 25％界面。在界面处的混浊带通过手动吸取以通常300-400μl的最小体积收集并充分混合。将10-15μl等分试样制成在液氮中快速冷冻的PCR管。在该测定中，从以上述方式分离的囊泡储液中取1μl通过EMCCD成像给每个视场约150-250个颗粒。
  5. 通过使用上述方法的放大版本，为需要胞质溶胶依赖性的研究产生了更大，更浓缩的囊泡批次。收获约3.5×10 9个GalT-YFP HEK细胞。在SW41管中Optiprep梯度增加了6.25倍，达到12.5ml总体积，然后在4℃以41,000rpm超速离心8小时。通过移液手动从梯度中抽取250μl级分。 Western blot分析（使用针对GalT-YFP构建体中的HA标签的α-HA抗体进行检测）显示具有最高信号（指示囊泡）的10％/ 25％界面区域附近的六个连续级分。汇集这些级分（总共1.5ml），等分并如上所述快速冷冻。在该测定中从该浓缩的囊泡储液中取出1μl通过EMCCD成像在每个视场中给出约1,000-1,500个颗粒。
7. 胞液
  1. 胞质溶胶制备方法改编自（Balch等，1984）。将四个T175细胞瓶培养至完全融合（总共约14-20×10 7个HEK293细胞）。使用胰蛋白酶-PBS缓冲液将细胞胰蛋白酶消化，然后用PBS洗涤4次，然后在冰冷的0.25M蔗糖，10mM HEPES，pH7.4中洗涤两次。将沉淀重悬于1.5ml相同的缓冲液中，从1M水溶液中加入新鲜的DTT至1mM。
  2. 在1ml紧密配合的Dounce匀浆器中用30次冲击处理悬浮液。将匀浆物转移到TLA100.3超速离心管中，并在4℃以60,000rpm离心45分钟。取出上清液并以相同方式再次离心以除去所有细胞碎片。同时，PD-10脱盐柱用100mM KCl，1mM DTT，10mM HEPES，pH7.2平衡。将清除的胞质溶胶上清液加入柱中。用相同的平衡缓冲液洗脱脱盐的胞质溶胶。通过Bradford蛋白质测定确定，大部分蛋白质包含在第一个2.5ml洗脱液中。蛋白质浓度通常为7.5-8.5mg / ml。将洗脱液充分混合，然后等分并在液氮中快速冷冻。
设置，孵化和安装
1. 设置
  注意：除了水以外，所有样品必须放置在与冷水混合的冰上（以使热交换良好），然后才能用于分析。
  1. 将水浴温度调至37°C。在解冻膜，细胞溶质和ATP / GTP混合物之前，准备所有其他试剂的稀释液。
    注意：在您的手中快速除霜膜等分试样和胞质溶胶，然后放在湿冰上。
  2. 囊泡，高尔基体，胞质溶胶和ATP的等分试样必须在除霜后直接在微型离心机中短暂离心（〜3秒）。
    注意：不要涡旋或轻弹膜，胞质溶胶或ATP / GTP，而是将移液器的体积设定为比等分量少10％，并在移除任何体积之前上下移液7次。相反，缓冲液应该在解冻后涡旋混合。
  3. 稀释囊泡储备以确保每个图像约70-150个囊泡。
    注意：
2. 孵化
  1. 典型的试验将含有：3.8微升高尔基体（见注1），4微升稀释囊泡股票，胞质溶胶中相当于57毫克总蛋白，胞质溶胶缓冲液（见配方），使得此总和和胞质溶胶体积为15.5微升，5微升10X浓缩的反应缓冲液（见配方），2.75微升测定蔗糖（见配方），5μl的10×浓缩的ATP / GTP混合物（见配方）在50μl总体积。在将25μl置于单独的试管中之前，将试验混合物轻轻地上下移液10次。将一半的测定混合物放在湿冰上，另一半转移到37℃的水浴中。
  2. 样品在黑暗中37℃孵育40分钟，然后转移回湿冰上。孵化后立即安装检测混合物。
3. 安装
  在安装之前，将硅珠悬浮液短暂涡旋，然后将1μl加入到测定混合物中。使用移液管设置为21μl将分析混合物上下移液20次，然后快速地将3μl作为两个单独的滴剂施加到载玻片的一半上并且立即用干净的方形盖玻片覆盖。用清晰的指甲油迅速密封边缘以防止样品蒸发并固定到位。同一试验的37℃和冰孵育的一半成对地安装在同一张载玻片上。幻灯片存放在4°C的冰箱中避光保存，直到成像。图1显示了样品安装是如何在整个执行化验的情况下执行的。
  
  图1.测定的执行将GalT-YFP囊泡和GalT-CFP高尔基体以50μl的总反应体积混合在一起，其中含有所需的反应条件。混合物被等分成两个管子。一个在0℃孵育40分钟作为内部对照，另一个在37℃孵育相同的时间。温育后，将5微米的二氧化硅珠与每个样品混合，然后立即将3μl的混合物以两个大致相同大小的斑点递送到显微镜载玻片上。样品用22×22毫米的盖玻片覆盖，在边缘密封，用二氧化硅珠子作为间隔物的清漆指甲油。幻灯片保持在4°C的黑暗，直到在室温下通过epifluorescence显微镜成像。
成像
1. 设备设置和控制
  1. 使用Evolve 512 EMCCD照相机通过明场显微镜采集图像，该照相机连接到ZEISS Axiovert 200M全电动倒置显微镜。照明由X-Cite 120Q激发光源提供。 X-Cite的可调光圈设置为4的3级，其中4级完全打开以获得最大输出。物镜是蔡司Plan-Apochromat 63x / 1.40油DIC。显微镜由ZEN 2009软件（ZEISS）控制，相机由与ZEISS软件相同的计算机系统运行的PM Capture Pro软件（Photometrics）控制。使用来自Chroma Technology Corporation的CFP和YFP滤光片。尽管没有使用共焦，但使用全电动舞台，滤光轮和百叶窗是必要的，因此使用这种显微镜。在成像过程中样品上的异常室内光线通过使用弱光条件而被最小化，并且还通过如下所述用亚光黑色卡片来遮蔽样品。在卡片的圆盘上（直径约7厘米），在中心切割一个圆孔，该圆孔略小于63x物镜上可伸缩前透镜外壳的直径。将前透镜轻轻地推入孔内，使圆盘形成一个宽的“领子”，从下面挡住光线，然后将一张带有中央矩形孔的卡片放在物镜上以覆盖间隙。随后，将通用安装框架（即，夹在机动平台中的部件）放置在矩形卡的上方以保持滑动件。在显微镜台上，将尺寸约为15×10×2厘米（L×W×H）的相同卡片的盒盖置于样品上（图2）。
    
    图2.在成像过程中屏蔽已安装的样品虽然在成像过程中使用了低照度的房间条件，但通过屏蔽，样品上的外来光线也被最小化。亚光黑卡的使用方法如下：1.在物镜周围安装一个宽领，以遮挡下方的光线; 2.将具有矩形孔的片放置在物镜上以覆盖间隙; 3.将浅箱盖置于顶部以阻挡来自上方的光线。图片2中的幻灯片放置在矩形片的顶部的通用安装框架中。
  2. 使用开源软件AutoHotkey编写脚本来自动控制ZEN 2009和PM Capture Pro软件。脚本（编程为通过按下键盘F键或游戏手柄的按钮（如<热键>）启动的脚本）移动光标，在适当的时间在显微镜和相机软件窗口中激活命令延迟。对脚本进行编程，使得改变滤波器，打开/关闭灯快门和摄像机图像采集的操作顺序发生，以获得囊泡（YFP通道）和高尔基体（CFP通道）各1个图像。这确保了所有的图像在相同的条件下被捕获，没有不必要的延迟，以避免荧光团的漂白。
2. 样品处理和图像采集
  1. 在成像之前几分钟，样品应该从冰箱中取出，以防止结露。一旦在显微镜上，房间必须切换到低光照条件，样品必须从上面和底部用上面和下面的无光泽黑色卡片遮盖外部光线。由于在明场照明下膜的对比度不足，所以聚焦是棘手的。初始聚焦应该针对使用低强度卤素灯的5μm玻璃珠。
  2. 然后，为了使用囊泡的YFP荧光进行更精细的对焦，必须使用EMCCD相机的高增益预览模式（请参见注释2）。它们太微弱，不能通过目镜看到，相机需要“看到”这些亚微米颗粒的精确焦平面。过度聚焦很容易，因此挤压样品，在这种情况下必须重新安装。一旦发现有囊泡的焦平面，应该小心，以便从坐在盖玻片上的粒子而不是在载玻片上的所有图像收集。从盖玻片快速重新聚焦将通过显示滑动附着的颗粒来验证这一点;这个检查应定期进行。在x-y平面上移动几个视野的距离通常会使焦点足够靠近，只需稍作调整即可重新获得焦点。
  3. 对于每个测定条件，需要收集每个温育温度12-16个图像。颗粒很快就会漂白，所以在拍摄图像之前，请注意整体对焦时间不要超过7秒。相机设置可能需要根据激发灯的使用年限进行调整。一组理想的设置在注2中。使用分档和高增益的非常短的曝光时间来找到合适的区域和聚焦。相反，长时间的曝光时间没有装箱和低增益被用来获取更高分辨率和更低噪声的囊泡和高尔基体的图像。需要编写脚本（例如使用用于PC的AutoHotkey程序）以使显微镜和相机执行的操作序列自动化以获取YFP和CFP通道的图像（如上所述）。这些脚本应该被编程为在按下单个“热键”（例如F键）时启动，或者甚至可以分配游戏手柄的按钮。这允许三个预设（参见注2）的单击启动，允许预览模式进行对焦，然后是YFP和CFP图像采集。
    注意：我们发现，用V_或G_前缀保存YFP（囊泡）和CFP（高尔基）通道图像，然后在文件名中加上一个时间标记进行编程的其他键，使得数据采集和后续处理的用户更多-友善。这也确保了来自同一视野的正确的囊泡和高尔基图像总是在一起后再配对。

数据分析

ImageJ被用来处理和分析所有图像。对于高尔基，图像被转换为8位，然后使用“减去背景”命令（滚动球半径2.0像素，滑动抛物面）减少背景噪声。阈值设置为“三角暗”，并将下阈值乘以系数1.1以确保选择高于背景噪声的粒子。选择二值图像，并填充任何包含孔的选定粒子。生成粒子数的总结。二进制图像的查找表已被更改为“红色”并保存。对泡囊图像进行相同的处理，除了在“三角暗”阈值之后，下阈值乘以因子1.4。二进制映像的查找表已更改为“绿色”并保存。高尔基和囊泡的倍增因子如果图像非常嘈杂，图像可能会增加，如果噪点较低，图像可能会增加。但是，同一个因素应该用于同一天收集的所有图像。打开高尔基（红色）和囊泡（绿色）二值图像，转换成RGB彩色图像，然后合并成复合图像，其中重叠的红色和绿色粒子相加以产生黄色像素。使用“连接阈值”插件（从 http://imagejdocu.tudor.lu 获得），阈值这个插件的对话框进行了调整，使高尔基选择蓝色，重叠（colocalized）的像素在红色，非colocalizing囊泡颗粒被排除在外。在对话框中选择“Hyst”（迟滞）命令。这导致包含一个或多个共定位像素的任何高尔基体粒子被填充为单个共定位事件，并且输出为二值图像。应用“255,255”的阈值并计数这样的共定位事件的数量。图3总结了这些图像处理操作。对高尔基体和囊泡图像进行的上述操作被编译成ImageJ宏（注3），允许将多个图像作为一批进行处理。在处理之后，应该查看所有图像以去除由5μm珠子引起的假阳性共定位事件，偶尔在两个通道中给出荧光信号，但是由于推定的粒子的形状，可以容易地将其与真实事件区分开。 br />

图3.图像处理工作流程（Cottam，2012）。 A.高尔基体和囊泡的原始图像用背景扣除处理。这也校正了（B）中产生图像的样本的轻微不均匀照明。 B.将强度阈值应用于图像以选择高于平均背景噪声的粒子。 C.选择被转换成二进制图像，并分别重新着色为洋红色和绿色的高尔基体和囊泡。 D.二进制图像被覆盖以将共定位区域显示为白色像素。 E.将滞后操作应用于重叠的图像，其完全填充任何包含白色像素的粒子以成为单个共定位事件。共定位事件的数量表示为粒子总数（共定位事件/（高尔基体+囊泡））的百分比，以给出测定活性的量度。在我们以前的工作中，我们使用了计算（高尔基+囊泡+共定位事件）的总粒子数量，这是不正确的，但应该考虑到数据与我们公布的结果进行比较时。考虑到共定位事件的数量通常较低（图4），当比较不同测定条件的结果时，由不正确的颗粒总量引起的失真不会改变生物学结果。比例尺= 10微米。
在Excel中，共定位颗粒的数量表示为颗粒总数的百分比（（colocalized /（Golgi + vesicles））;参见图3的说明中的解释）。这给了样本中活动的百分比。然后将每个测定条件下37℃孵育的活性标准化为相应的冰对照的活性，给出每个条件的标准化活性（即，与冰对照相比倍数增加）（见图4）。背景活动每天都有所不同。但是，我们发现在一天内进行超过六个独立条件的测定是不实际的。因此引入了进一步的标准化步骤，其中将每个条件的标准化活性进一步标准化为当天测量的野生型（或其他合适的）对照样品。按照这种方式在不同的测量日对相同的控制进行标准化的活动可以进行稳健的比较和平均。

图4.图像处理结果的典型数据表每个图像都显示了粒子数量以及共定位粒子的数量。

笔记

当遵循上述制备方案时，制备物的浓度允许测定中高尔基体膜的量非常接近3.8μl，每个图像约70-150个颗粒。如果高尔基制剂的浓度差别很大，则需要注意平衡加入蔗糖缓冲液的高尔基体的量，使得最终测定混合物的渗透压不会离310mOsm的DMEM差不多太远。 >
PM Capture Pro软件中的摄像机预设参数：
1. 预设1预览模式（高增益，高噪音），以找到正确的区域和快速对焦：
  2 x 2分档，模拟数字增益3，曝光120毫秒，电子倍增增益= 220
2. 预置2-YFP捕捉（低增益，低噪音）：
  1×1分档，模拟 - 数字增益3，曝光4.5秒，电子倍增= 22
3. 预设3-CFP捕捉（低增益，低噪音）：
  1×1组合，模拟数字增益3，曝光2.6秒，电子倍增增益= 8
ImageJ的宏
1. YFP小泡处理：
  
  for（i = 1; i <= nImages; i ++）{
  selectImage（i）;
  run（“8-bit”）;
  run（“Subtract Background ...”，“rolling = 2 sliding”）;
  setAutoThreshold（“Triangle dark”）;
  getThreshold（lower，upper）;
  setThreshold（lower * 1.4，255）;
  run（“Make Binary”，“thresholded remaining black”）;
  run（“Invert”）;
  run（“Fill Holes”）;
  setThreshold（255，255）;
  run（“Analyze Particles ...”，“size = 0-infinity circularity = 0.00-1.00 show = Nothing clear include summarize”）; /> run（“Green”）;
  }
  run（“Images to Stack”，“name = YFP_stack stack title = [] use”）;
  saveAs（“Tiff”）
2. CFP高尔基处理：
  
  for（i = 1; i <= nImages; i ++）{
  selectImage（i）;
  run（“8-bit”）;
  run（“Subtract Background ...”，“rolling = 2 sliding”）;
  setAutoThreshold（“Triangle dark”）;
  getThreshold（lower，upper）;
  setThreshold（lower * 1.1，255）;
  run（“Make Binary”，“thresholded remaining black”）;
  run（“Invert”）;
  run（“Fill Holes”）;
  setThreshold（255，255）;
  run（“Analyze Particles ...”，“size = 0-infinity circularity = 0.00-1.00 show = Nothing clear include summarize”）; /> run（“Red”）;
  }
  run（“Images to Stack”，“name = CFP_stack stack title = [] use”）;
  saveAs（“Tiff”）
3. 要生成合并的RGB堆栈：
  
  for（i = 1; i <= nImages; i ++）{
  selectImage（i）;
  run（“RGB Color”）;
  }
  run（“合并通道...”，“red = CFP_stack.tif green = YFP_stack.tif blue = * None * gray = * None * create”）; / span>
  saveAs（“Tiff”）

食谱

分析蔗糖
1.2 M蔗糖
10 mM HEPES，pH 7.4
ATP / GTP混合物（10x）
肌酸磷酸激酶1,500 U / ml
10 mM GTP
5 mM ATP
200毫克磷酸肌酸
7.5 mM KOH中和ATP
20 mM HEPES，pH 7.4
Cytosol缓冲液
100 mM KCl
1 mM DTT
10 mM HEPES，pH 7.2
HM缓冲区
10 mM HEPES，pH 7.2
2.5mM Mg（OAc）2•/ 2
KHM缓冲区
150 mM KCl
2.5mM Mg（OAc）2•/ 2 10 mM HEPES，pH 7.2
反应缓冲液（10x）
250 mM HEPES，pH 7.4
20 mM MgCl 2 2/2
胰蛋白酶-PBS缓冲液
PBS中0.25％（v / v）胰蛋白酶

致谢

我们非常感谢约克大学生物科学技术研究所的成像设施。这项工作得到了杜博士和居里夫人（201098）支持的BBSRC博士生支持。该协议发表于（Cottam et al。，2014）。作者声明不存在利益冲突。

参考

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