第一部分：量化T。 cruzi 在组织中

下面的方案（Kitada等人，2017）从前述方法（Cencig等人，2011; Caldas等人， em>，2012）。

材料和试剂

移液器吸头（Labcon，目录号：1093-260-000,1045-260-000,1036-260-000）
15cm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：150468）
血液采集管CAPIJECT（Terumo，目录号：CJ-NA）
10厘米培养皿（Sansyo，目录号：36-3406）
1.5ml微管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：131-415C）
处理血细胞计数器（All-Biz，目录号：4109：37650）
8周龄的雄性和雌性C57BL / 6小鼠（日本SLC）
LLC-MK2细胞（恒河猴肾上皮细胞），由S.Hamao教授（长崎大学热带医学研究所）提供，也可在ATCC获得。有关LLC-MK 2 细胞的信息可在 https://www.atcc.org/en/Products/Cells_and_Microorganisms/By_Tissue/Kidney/CCL-7.aspx#documentation
克氏锥虫图拉胡恩菌株（S.Hanmano教授（长崎大学热带医学研究所））
10毫克/毫升蛋白酶K（Merck，目录号：124568）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（NACALAI TESQUE，目录号：25970-56）
氯仿（JUNSEI CHEMICAL，目录号：28560-0330）
2-丙醇（JUNSEI CHEMICAL，目录号：64605-0330）
70％乙醇（JUNSEI CHEMICAL，目录号：17065-0382）
TE缓冲溶液（pH 8.0）（NACALAI TESQUE，目录号：32739-31）
Go Taq qPCR Master Mix（Promega，目录号：A6002）
RPMI 1640（NACALAI TESQUE，目录号：30264-56）
引物（Invitrogen定制DNA引物）
吨。（Tc1），5'-cgagctgttgcccacacgggtgct-3'和5'-cctccaagcagcggatagttcagg-3'（Cencig et al。，2011）。和TNF-αDNA引物5'-tccctctcatcagttctatggccca-3'和5'-cagcaagcatctatgcacttagacccc-3'（Caldas等人，2012）。
裂解缓冲液（见食谱）
1. Tris-HCl（NACALAI TESQUE，目录号：35434-21）
2. 乙二胺四乙酸（EDTA）（NACALAI TESQUE，目录号：06894-14）
3. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：311-90271）
4. 氯化钾（NaCl）（JUNSEI CHEMICAL，目录编号：19015-0350）
RPMI 1640培养基（见食谱）
1. 胎牛血清（CCB，目录号：171012）
2. 青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
3. 2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21985023）

设备

移液器（Nichiryo，产品目录号：00-NPX2-1000,00-NPX2-200,00-NPX2-20,00-NPX2-2）
镊子（Hammacher，目录号：HSC_553-11）
微量天平（Chyo Balance，型号：JPN-200W）
剪刀（精细科学工具，目录号：91460-11）
摇摇培养箱（TAITEC，型号：BR-43FM MR）
离心机（TOMY SEIKO，型号：MX-200）
涡流
实时PCR热循环仪：Step One Plus TM系统实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：StepOnePlus TM TM >，目录号：4376600）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000）

程序

吨。 cruzi 准备
1. 将5×10 5 -1×10 6 LLC-MK 2细胞在感染前的第1天接种到15cm培养皿中。 br />
2. 在步骤A1中接种的LLC-MK 2细胞被2×10 6 T细胞感染。 cruzi Tulahuen（MOI = 2）。
3. 每3天更换培养基（20毫升）。在图1A中，无花果被显示在 T中。克拉霉素感染的细胞（图A），其区分为释放到培养基中的感染形式trypomastigotes（图B）。
4. 感染7天后，显微镜下计数培养上清液中的trypomastigotes（图1）。大约2×10 7个trypomastigotes获得。
  
  图1. T的示意图。 cruzi 在血细胞计数器。 A. Amastigotes; B. Trypomastigotes。
制备组织标准品和定量PCR
1. 将未受感染的小鼠的肝脏和心脏收集到15厘米培养皿中，并在CAPIJECT试管中收集血液（超过200μl）。
2. 用剪刀将心脏和肝脏切成小块，加1×10-6T。在1.5ml微型管中，将来自未感染的C57BL / 6小鼠的克氏锥虫放入30mg心脏，30mg肝脏或200μl血液中。
3. 加入500μL裂解缓冲液（见食谱）和5μL10mg/ ml蛋白酶K，并在摇动培养箱（振荡速度：110次/分钟）中于55℃孵育18小时。
4. 13000×g离心10分钟，4℃
5. 将上清转移到新鲜的1.5毫升微型管中。
6. 加入500μl酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），并用涡旋混合微管的内容物。
7. 13000×g离心10分钟，4℃
8. 将上层转移到新鲜的1.5毫升微型管。
9. 加入500μl氯仿，并用涡旋混合微管的内容物。
10. 13000×g离心10分钟，4℃
11. 将上层转移到新鲜的1.5毫升微型管。
12. 加入500μl2-丙醇，并使用涡旋混合微管的内容物。
13. 在4℃下在13,000×gg下离心10分钟。
14. 吸取上清液，并轻轻地在500微升70％乙醇洗颗粒。
15. 5,500×g离心5分钟，4℃
16. 吸出上清液，风干10分钟。
17. 将DNA沉淀溶解在TE缓冲溶液（pH8.0）中并测量DNA的浓度以产生25μg/ ml组织DNA。
18. 来自添加有T的组织的DNA。将来自不含T的组织的25μg/ ml DNA依次稀释10倍。 cruzi （图2）。制备的标准品含有每50ng总DNA含有10 -3 -10 -10 -2个寄生虫的DNA。标准曲线来确定T的量。克氏锥虫感染的小鼠的组织中的DNA是使用这些标准产生的。移液器吸头应在每次稀释之间更换。
  
  图2.生成组织标准物的方案方案在组织中定量克氏锥虫
19. 为了评估TNF-αDNA的量的标准曲线，含有1×10 3个T的25mg / ml组织DNA。（STD1），随后用蒸馏水或TE缓冲液稀释10倍（图3）。使用内部对照'TNF-αDNA'来标准化在每个PCR反应中被分析的组织的量（Cummings和Tarleton，2003; Caldas等人，2012）。移液器吸头应在每次稀释之间更换。
  
  图3.制备标准品的方案，以量化组织TNF-αDNA
20. 通过qPCR产生克氏锥虫和TNF-α标准校准曲线（图4A和4B）
  1. 混合以下组件
    10μlGo Taq qPCR Master Mix
    1μl的10μMT。 cruzi 特异性引物（Tc1）或TNF-αDNA引物
    2微升的DNA标准。 cruzi（图2）或TNF-αDNA（图3）
    7μl双蒸水
  2. 扩增协议
    95℃10分钟，以及94℃15秒和64.3℃1分钟的40个循环。
    在伸长步骤结束时测量荧光发射（520nm）。熔解曲线阶段程序应用在65°C和95°C之间的连续荧光测量。每个DNA样本都从两个独立的qPCR运行重复进行定量。
    
    图4.使用或不使用T的未感染小鼠的肝脏的DNA产生的标准曲线。 cruzi痘病毒A和B.用如上所述制备的10倍稀释系列用特异于T的引物扩增。 cruzi DNA（A）或鼠TNF-αDNA（B）。标准曲线是从每个样品应用曲线的线性区域产生的。
量化 T。克氏锥虫感染小鼠的组织中的DNA
1. 给小鼠（至少5只小鼠）腹膜内注射250μl包括5×10 -2 T的PBS。如步骤A1-A4中制备的克氏锥虫鞭毛虫。
2. 感染后第20天和第30天，从小鼠收集心脏，肝脏和血液。
3. 将30毫克心脏或肝脏或200微升血液与500微升裂解缓冲液/ 5微升10毫克/毫升蛋白酶K于55℃在摇动培养箱（110分钟-1）中温育18小时h。
4. 来自从T分离的组织的DNA。如上所述提取克鲁兹感染的小鼠（步骤B4-B17）。
5. 标准化 T。 cruzi 在组织中加载DNA。
  为了使在每个PCR反应中分析的组织量正常化，使用鼠TNF-αDNA来校正起始样品量，样品加载量和DNA回收率的样品内变化（Cummings and Tarleton，2003）。 T。 cruzi根据图4所示的已知浓度的每个标准品绘制Ct值，自动计算DNA值和TNF-αDNA值。 cruzi DNA值=（cruze cruzi DNA值/ TNF-αDNA值）×10，其中10对应于来自30mg心脏/肝脏或200μgTNF-α的预期值μl血液（Caldas等人，2012）。

第二部分：T。 cruzi 杀死测定

材料和试剂

移液器吸头（Labcon，目录号：1093-260-000,1045-260-000,1036-260-000）
10毫升注射器（Terumo，目录号：SS-10SZP）
26克针（Terumo，目录号：NN2613S）
细胞过滤器40微米尼龙（Corning，Falcon ，目录号：352340）
50ml试管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：339652）
10cm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：150466）
刮刀（康宁，目录编号：3008）
24孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：142475）
玻璃盖玻片（13毫米）（Matsunami玻璃，目录号：C013001）
幻灯片（MUTO PURE CHEMICALS，目录号：110510）
处理血细胞计数器（All-Biz，目录号：4109：37650）
6厘米培养皿（AS ONE，目录号：1-8549-02）
8周龄的雄性和雌性C57BL / 6小鼠（日本SLC）
克氏锥虫图拉胡恩菌株（由长崎大学热带医学研究所滨田教授赠送）
ISOFLURANE吸入溶液（辉瑞）
70％乙醇（JUNSEI CHEMICAL，目录号：17065-0382）
HBSS（NACALAI TESQUE，目录号：17460-15）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（NACALAI TESQUE，目录号：14249-24）
GM-CSF（Wako Pure Chemical Industries，目录号：077-04674）
含0.02％EDTA（NACALAI TESQUE，目录号：06894-14）的0.25％胰蛋白酶（NACALAI TESQUE，目录号：35555-54）
IFN-γ（PeproTech，目录号：315-05）
4％多聚甲醛（NACALAI TESQUE，目录号：09154-85）
Diff-Quik（Sysmex，目录号：16920）
RPMI 1640（NACALAI TESQUE，目录号：30264-56）
ACK裂解缓冲液（pH 7.2-7.4）（见食谱）
1. 氯化铵（NH 4 Cl）（NAKALAI TESQUE，目录号：02423-65）
2. 碳酸氢钾（KHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03285）
3. EDTA（NAKALAI TESQUE，目录号：06894-14）
RPMI 1640培养基（见食谱）
1. 胎牛血清（俄勒冈州建筑承包商委员会，目录号：171012）
2. 青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
3. 2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21985-023）

设备

移液器（Nichiryo，产品目录号：00-NPX2-1000,00-NPX2-200,00-NPX2-20,00-NPX2-2）
剪刀（MIZUHO，目录号：09-207-00）
镊子（Hammacher，目录号：HSC_553-11）
显微镜（奥林巴斯，型号：CX31）
手持计数器（精机线，目录号：H-102）
离心机（TOMY SEIKO，型号：AX-310）

程序

骨髓来源的巨噬细胞的制备
注：以下协议涉及以前的报告（Weischenfeldt和Porse，2008）。
1. 用异氟醚吸入溶液安乐死小鼠。
2. 用70％乙醇消毒后腿和腹部
3. 在腹部中线做一个切口。
4. 向外夹，露出后腿。
5. 使用剪刀去除骨骼中的所有肌肉，并切断股骨根部的骨骼
6. 在两个下肢切骨后，在培养皿的膝关节切开股骨和胫骨。
7. 使用10毫升注射器和26克针头用HBSS冲洗骨骼。
8. 将骨髓细胞穿过50ml管中的细胞过滤器。
9. 在240℃下离心5分钟
10. 吸出上清液，并加入1毫升ACK裂解缓冲液（见食谱）在室温下裂解红细胞。
11. 3分钟后，加入9毫升冷PBS。
12. 在240℃下离心5分钟
13. 吸出上清液。
14. 在10cm培养皿中，在10ml RPMI 1640培养基（见配方）中培养2×10 7个从小鼠下肢分离的骨髓细胞（参见配方），所述RPMI 1640培养基补充有10ng / ml GM-CSF。
15. 每2天用PBS洗涤细胞两次，加入含有10ng / ml GM-CSF的新鲜RPMI 1640培养基。
16. 6天后，吸出上清液，并添加10毫升PBS。
17. 吸出PBS并加入1ml含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶。
  在37°C孵育5分钟
18. 加入10毫升RPMI 1640培养基，并用刮刀刮细胞。
19. 收集在RPMI 1640培养基中的细胞到50毫升管。
20. 在240℃下离心5分钟
21. 吸出上清液。
22. 将玻璃盖玻片经灭菌处理灭菌，放入24孔板的孔中。
23. 在含有10ng / ml GM-CSF的500μlRPMI 1640培养基的玻璃盖玻片上板5×10 4个骨髓来源的巨噬细胞。
24. 18小时后，在克氏锥虫杀伤试验中使用骨髓来源的巨噬细胞。
吨。 cruzi 杀死测定法
1. 将在步骤A23-A25中制备的骨髓来源的巨噬细胞与500μlRPMI 1640培养基一起在0,1,10或100ng / ml IFN-γ存在下培养18小时，吞噬细胞。
2. 吸出上清液，用500μlPBS洗5次。
3. 加入500μl含10ng / ml GM-CSF的RPMI 1640培养基。
4. 感染5×10 -4 Tm。 cruzi trypomastigotes与巨噬细胞6小时（MOI = 1）。
5. 用500μlPBS洗涤3次后，加入500μl含有10ng / ml GM-CSF的RPMI 1640培养基并培养72小时。
6. 吸出的培养基，并用500μLPBS洗。
7. 用500μl4％多聚甲醛固定细胞，并在室温下孵育10分钟。
8. 为了可视化细胞内的无鞭毛体，使用Diff-Quik试剂盒染色细胞。
9. 使用镊子将盖玻片盖在载玻片上
10. 在显微镜下计算细胞内无鞭毛体的数量（图5）。
  
  图5.细胞内寄生虫感染T细胞的骨髓来源的巨噬细胞。 cruzi 在存在或不存在IFN-γ的情况下持续6小时，剧烈洗涤并培养72小时。将细胞固定并用Diff-Quik染色。原始放大倍率，400倍。 *表示核。箭头表示无鞭打。
11. 在光镜下计数200个巨噬细胞内的细胞内寄生虫数量（图6）
  
  图6.细胞内无鞭毛体的数目每200个巨噬细胞的寄生虫数量。图表表示来自三个独立实验的平均值±SD。 * P ＆lt; 0.05。对照组和实验组之间的差异使用Student's检验进行评估。 P 的差异< 0.05被认为是显着的。

食谱

裂解缓冲液
100mM Tris-HCl（pH8.5）
5 mM EDTA
0.2％SDS
200 mM NaCl
RPMI 1640培养基
10％胎牛血清
100μg/ ml链霉素，100U / ml青霉素
100μM2-巯基乙醇
ACK裂解缓冲液（pH 7.2-7.4）
0.15M NH 4 Cl Cl / 1mM KHCO 3
0.1mM EDTA

致谢

这项工作得到日本文部科学省和日本医学研究开发机构（KT和HK）以及金原一郎基金会和仓田纪念日立科学的资助和技术基金会（香港）。这里提供的协议是由S.Cencing等人（2011）和S.Caldas等人的先前描述的方法部分修改的。（2012）（克拉霉素的量化）和J.Weischenfeldt和B.Porse（2008）（骨髓衍生的巨噬细胞的制备）。我们感谢Edanz集团（www.edanzediting.com/ac）的Kate Fox，DPhil编辑本稿的草稿。作者声明，他们没有竞争的财务利益。

参考

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