材料和试剂

6孔细胞培养板（Corning，Costar ，目录号：3516）
塑料移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：T-1000-B）
无菌1.5ml离心管（Corning，Axygen，目录号：MCT-175-C）
15ml和50ml离心管（Corning，Falcon，产品目录号：352096和352070）。
培养皿（Corning，Falcon ，目录编号：351029）
细胞提升器（康宁，目录号：3008）
12孔MEA板（Axion BioSystem，目录号：M768-GL1-30Pt200）
0.22微米过滤器（Corning，目录号：431097）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
无菌水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15230162）
Dispase（STEMCELL Technologies，目录号：07923）
Y-27632（STEMCELL Technologies，目录号：72302）
层粘连蛋白（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：23017015）
LDN-193819（Stemgent，目录号：04-0074）
SB431542（Sigma-Aldrich，目录号：S4317）
XAV939（Stemgent，目录号：04-0046）
重组人声波刺猬（SHH）（R＆amp; D Systems，目录号：464-SH-025）
脑源性神经营养因子（BDNF）（R＆amp; D Systems，目录号：248-BD-025）
胶质源性神经营养因子（GDNF）（R＆amp; D Systems，目录号：212-GD-050）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4403）
Ñ 6 ，2'-O-二丁3’ ，5'-环一磷酸钠盐（dbcAMP）（Sigma-Aldrich公司，目录号：D0260）
50％聚（乙烯亚胺）（PEI）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P3143）
Accutase（STEMCELL Technologies，目录号：07920）
河豚毒素（TTX）（Alomone Labs，目录号：T-500）
N2（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17502048）
B27（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
改良伊格尔培养基 - 非必需氨基酸（MEM-NEAA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11140050）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
Dulbecco改良的Eagle's培养基：营养混合物F-12（DMEM / F12）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11320082）
神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21103049）
N2 Supplement-A（STEMCELL Technologies，目录号：07152）
NeuroCult TM SM1（STEMCELL Technologies，目录号：05711）
BrainPhys TM神经元培养基（STEMCELL Technologies，目录号：05790）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
四硼酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：221732）
盐酸发烟37％（Merck，目录号：100317）
N2B27培养基（见方法1）
BrainPhys培养基（见方法2）
硼酸盐缓冲液（见方法3）

设备

移液器
P10（Gilson，目录号：F144802）
P200（Gilson，目录号：F123601）
P1000（Gilson，目录号：F123602）
组织培养罩（Gelman，型号：BH Class II Type A2系列）
37℃水浴（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Labline 183，目录号：2835）。
细胞培养培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell TM 150i CO 2，目录号：50116047）
离心机（Eppendorf，型号：5810，目录号：5810000424）
细胞计数器Countess II（Thermo Fisher Scientific，型号：Countess TM II，目录号：AMQAX1000）
相差显微镜（Leica DMIL LED倒置荧光显微镜）（Leica Microsystems，型号：Leica DM IL LED）
Maestro MEA系统（ Axion生物系统）

软件

Axion生物系统集成工作室（AxIS，Axion生物系统）
神经测量工具（Axion Biosystem）
Neuroexplorer（NEX，Plexon）
MATLAB（R2016a）
Excel（Microsoft Office）

程序

hiPSC衍生的神经元的制备
如前所述，前脑神经元与hiPSC分化（Xu等人，2017）。
1. 从保存在6孔板中的hiPSC的孔中吸取旧培养基。
2. 向孔中加入1ml分散酶（1mg / ml），并在37℃孵育5分钟。
3. 加入2毫升的DMEM / F12的井和提升的细胞团转移到15毫升离心管使用5毫升塑料移液器。
4. 在室温下将细胞以160×g离心3分钟
5. 去除并丢弃上清液。
6. 重新悬浮并用10毫升DMEM / F12冲洗细胞团块两次以除去剩余的分散酶。
  注意：通过多次清洗完全去除分配是非常重要的。
  
  如果未能移除分配，电镀时会影响电池重新连接。
7. 使用补充有10μMY-27632的10ml N2B27培养基重新悬浮细胞团（参见配方1），并将其在未涂覆的10cm培养皿中于37℃培养8小时。
8. 收集细胞聚集物，并将它们在补充有100nMLDN193189,10μMSB431542和2μMXAV939的N2B27培养基中预涂有10μg/ ml聚-L-鸟氨酸和10μg/ ml层粘连蛋白的培养皿上培养。
9. 从第5天起，将200ng / ml的SHH加入到分化细胞中。
10. 每隔一天更换一次。
11. 在第15天，用细胞提升器以1:1的分流比传代细胞。
注：这些细胞将被称为神经祖细胞（NPC）。
1. 在补充有20ng / ml BDNF，2μMXAV939和200ng / ml SHH的N2B27培养基中展开NPC 5天。
2. 对于神经元分化，将NPCs在补充有20ng / ml BDNF和20ng / ml GDNF，0.2mM抗坏血酸和0.5mM dbcAMP的N2B27培养基中培养。
3. 每三天交换50％中。
  注意：在46到50天的神经元被解离并重新涂在MEA板上。
MEA板涂层
根据MEA平板上的Axion细胞培养方案，在接种神经元之前，用PEI溶液包裹MEA平板。
（ https://www.axionbiosystems.com/sites/default/files/资源/ icell_neuron_culture_protocol.pdf ）。
1. 通过在硼酸盐缓冲液中稀释50％PEI溶液来制备0.1％PEI溶液（参见方案3）。
2. 通过0.22μm过滤器过滤0.1％PEI溶液。
  注：0.1％PEI溶液可以在4°C下保存长达1个月。
3. 加入200μl的0.1％PEI溶液到MEA平板的每个孔中，并在室温下孵育平板1小时。
4. 从MEA板上吸取PEI溶液。
5. 用500μl无菌水冲洗每个孔4次
6. 在组织培养罩中盖上隔夜的MEA板风干。
  注意：让MEA板过夜风干以达到最佳的细胞粘附是必不可少的。
播种神经元
1. 从神经元中吸出培养基，并加入1ml DMEM / F12在室温下洗一次神经元。
2. 吸出DMEM / F12，添加0.5毫升accutase到神经元，孵化5分钟，在37°C孵化器。
3. 加入2毫升的DMEM / F12细胞，并轻轻吸管上下几次。
4. 将细胞悬液转移到15ml离心管中，用2ml DMEM / F12洗板一次，将所有细胞转移到15ml离心管中。
5. 重悬细胞，并使用细胞计数器取10μl用于活细胞计数。
  注意：温和的移液是增加细胞活力的必要条件。
6. 在室温下将201×g离心细胞4分钟
7. 。将细胞沉淀上方的上清液吸出，不要搅动沉淀
8. 将完全N2B27培养基中的层粘连蛋白溶液稀释至终浓度为10μg/ ml。
  注意：在4°C解冻层粘连蛋白库存，不要涡旋层粘连蛋白溶液。
9. 使用10μg/ ml层粘连蛋白溶液重悬细胞沉淀至终浓度为28,000活细胞/μl。
10. 将5μl悬浮液（140,000个细胞）直接在每个PEI涂覆的孔的中心上在记录电极区域上接种。
  注意：不要让提示碰到MEA板的底部。
11. 将无菌水添加到MEA板的孔周围以防止基质蒸发（图2A）。
  注意：在步骤C13添加介质后，不再需要MEA水库水。
12. 将带有种子的神经元的MEA平板在37℃培养箱中孵育1小时。
  注意：在添加额外的N2B27培养基之前，不要让细胞悬液液滴干燥。
13. 轻轻加入100μl完整的N2B27培养基到MEA平板各孔的一侧（图2B）
14. 重复步骤C13四次以达到500μl/孔的最终体积。
15. 在含有5％CO 2的37℃培养箱中孵育MEA板。
16. 第二天，抽出用过的培养基并加入1ml新鲜的N2B27培养基或补充有20ng / ml BDNF，20ng / ml GDNF，0.5mM dbcAMP和0.2mM抗坏血酸的Brainphys培养基（见方案2）。
  注意：使用相差显微镜可以观察神经元（图2D-2E）。
17. 每隔2-3天更换50％培养基，每孔吸取500μl废培养基，加入500μl新鲜完全培养基。
  注意：为避免即时培养基变化对神经元活动的影响，请在最后一次培养基更换后1小时内开始记录。
  
  图2. MEA印版处理的代表性图像。用无菌水MEA板周围的井防止蒸发（一）。推荐将培养基移液到MEA孔中以避免破坏细胞的方法（B）。将MEA板置于板腔（C）中。（D）周围的hiPSC衍生的神经元。（D）中标记的白色正方形的放大视图，显示了围绕记录电极（E）之一的神经元。比例尺= 100微米。
MEA记录和数据采集
1. 打开Maestro MEA系统，使用Middleman背面的电源开关。
2. 启动AxIS软件并点击温度图标到37°C。
3. 在AxIS中设置实验（图3）：
  1. 通过从配置中选择神经模式调整Maestro采集设置。
  2. 设置模拟设置，选择“神经：尖峰（1,200×增益，200-5,000赫兹）”。
  3. 使用“中位数”参考来减少神经模式中的噪音。
  4. 选择数据流进行录制。
  5. 选择录制时间。
    注意：神经元活动变化很大，通常需要至少5分钟才能获得足够的统计数据。
  6. 添加实验说明，笔记和版图。
4. 将MEA板放入板腔（图2C）。
  注意：请勿触摸MEA板的金属底部。
5. 在Maestro上平衡平板5-10分钟
6. 点击“播放”开始电压偏移，然后等待完成。
7. 按“开始时间表”记录数据。
8. 一旦记录完成，数据将自动保存。
  
  图3. AxIS中实验设置的快照
TTX治疗
河豚毒素（TTX）是一种有效的神经毒素，通过与神经细胞膜上的电压门控钠通道结合，阻断钠离子进入神经元，抑制神经元动作电位的发放。在这里，我们测试hiPSC派生的神经元是否可以对TTX治疗产生反应（图4和5）。
1. 在pH 7.4的乙酸钠缓冲液中溶解TTX，得到1 mM的储存液
2. 在添加TTX之前记录MEA板的基线。
3. 向MEA孔中加入0.5μlTTX，使终浓度达到1μMTTX。
4. 孵育细胞5分钟。
5. 记录TTX治疗后的数据。
6. 用BrainPhys培养基冲洗TTX，孵育过夜。
7. 记录TTX清除后的神经元活动。
数据过滤和数据提取
由于原始数据采样频率为12.5 kHz，因此可以在低频段（10-300 Hz），代表局部场电位（LFP）信号（Buzskiki et al。， 2012），以及动作电位（AP）（Quian Quiroga和Panzeri，2009）的高频段。对于我们目前的研究，我们选择侧重于细胞外AP量化和高通滤波的数据。根据以下步骤使用AxIS进行数据和尖峰检测（作为时间戳）的过滤：
1. 录制的原始数据文件（ .csv ）在AxIS中打开。使用AxIS数字滤波器在200Hz-3kHz范围内对数据进行带通滤波以产生多单元数据。使用设定为高于平均噪声水平6倍标准差（6SD）的阈值检测神经元峰值（Pouzat等，。每个记录日获得一个新的文件（。 spk ），其中包含尖峰时间戳和波形以及电极（通道）和油井指数等信息。
2. 随后将多单元峰值数据导入到NEX，其中包含一个工具箱来识别AxIS。 spk 数据格式。在NEX中，秒杀数据作为时间戳输出到MATLAB，并按每个通道分组
3. 在MATLAB中，每个单独的记录都被保存为。 mat 文件，然后加载进行分析。

数据分析

内置和自定义的书面MATLAB函数被用来生成栅格图，并说明所调查条件的尖峰活动通过实验的栅格图用于目视检查随时间推移其总体掺加活性与对照孔不同的孔。任何不寻常的活动，或模式，进一步调查使用刺激间期，突发分析或尖峰频率分析（见下文）。每个井都在一个单独的栅格图中进行了说明，并标有相应的条件名称。对于每个单独的频道，检测到的每个尖峰的时间戳都以图形方式绘制。在栅格图中，每列（y轴）代表与每个电极对应的通道编号，而列（x轴）代表检测到每个峰值的时间（图4）。
峰活性分析包括计算每个实验条件的峰值总数，平均峰值频率和最大峰值频率，以及无响应信道（或没有尖峰活动的信道）的总数。在这种情况下，每种情况都由三口井代表。

图4.代表从基线，TTX处理和TTX洗脱的单个通道峰电活动的代表性栅格图。在基线（A）期间显示高峰电活动的栅格图，其通过应用1μMTTX完全消除（B），TTX（C）冲洗后回收。 x轴对应于时间，y轴对应于通道。

几个参数被初始化，包括实验日期，实验条件（即em>，控制，处理，媒体等等）和well标签。
由于各个实验的记录时间略有不同，因此数据被截断至记录的前300秒，只有相关的时间戳才能进行进一步的分析。
没有加标活动的井或通道，或只检测到一个加标记的通道被排除在频率分析之外。
对每个孔计数没有加标活动的通道总数。每个实验条件的平均通道数被平均。
每个通道内的每个通道计数出现的峰值总数
每个通道的峰值频率计算为峰值总数除以记录时间。
将含有相同细胞类型的孔在相同的实验条件下合并在一起进行描述性统计分析。
根据Grubbs测试（Grubbs，1950）的迭代实施，Brett Shoelson在2009年使用定制函数删除了异常值。
针对每个孔（或者如果一个条件包括多于一个孔的孔）计算峰值频率的描述性统计，如平均值，最大值和平均值的标准误差（SEM）。
以条形图格式绘制数据以说明条件（图5A和5B）之间的平均和最大峰电频率的差异，以及没有尖峰活动的通道数量（图5C）。

图5. TTX对hiPSC衍生的神经元的影响。平均尖峰频率（A），最大尖峰频率（B）和代表hiPSC衍生的神经元的无峰电流活动的平均数量（C）。条形图显示平均值±SEM。

食谱

N2B27培养基（500毫升）
5毫升N2
10毫升B27
5毫升MEM-NEAA
2.5毫升L-谷氨酰胺
5毫升Pen-Strep
236.25毫升DMEM / F12

236.25毫升神经基础培养基
BrainPhys中等（500毫升）
10毫升NeuroCult TM SM1神经元补充剂
5毫升N2补充-A
485毫升BrainPhys TM神经元培养基
硼酸盐缓冲液（500毫升）
1.55克硼酸
2.375克四硼酸钠
500毫升蒸馏水
调整到最终的pH值为8.4

致谢

所描述的方法先前在Xu等人发表。（2017）。这项工作部分由科学技术与研究机构（新加坡）的遗传孤独病战略定位基金（SPF2012 / 005）和联合理事会办公室项目资助（1431AFG122）资助，一级资助R-172- 000-297-112从教育部（新加坡）到MAP C.R.得到A * STAR研究附件计划（ARAP）的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Buzsáki，G.，Anastassiou，C.A。和Koch，C。（2012）。细胞外场和电流的起源 - 脑电，ECoG，LFP和尖峰 Nat Rev Neurosci 13（6）：407-420。
Grubbs，F.E。（1950）。测试外围观测的样本标准 “数理统计年鉴” 21（1）：27-58。
Hutzler，M.，Lambacher，A.，Eversmann，B.，Jenkner，M.，Thewes，R.和Fromherz，P.（2006）。高分辨率多晶体管阵列记录培养脑切片中的电场电位 J Neurophysiol 96（3）：1638-1645。
Neher，E.，Sakmann，B。和Steinbach，J.H。（1978）。细胞外膜片钳：一种解决生物膜中单个开放通道电流的方法。 Pflugers Arch 375（2）：219-228。
Obien，M.E.，Deligkaris，K.，Bullmann，T.，Bakkum，D.J。和Frey，U。（2014）。通过微电极阵列记录揭示神经元功能 Front Neurosci 8：423.
Pouzat，C.，Mazor，O。和Laurent，G。（2002）。使用噪音特征来优化穗分选和评估神经元分类质量 J Neurosci方法 122（1）：43-57。
Quian Quiroga，R.和Panzeri，S。（2009）。从神经元种群中提取信息：信息理论和解码方法 Nat Rev Neurosci 10（3）：173-185。
Xu，X.，Tay，Y.，Sim，B.，Yoon，SI，Huang，Y.，Ooi，J.，Utami，KH，Ziaei，A.，Ng，B.，Radulescu，C.，Low， D.，Ng，AY，Loh，M.，Venkatesh，B.，Ginhoux，F.，Augustine，GJ和Pouladi，MA（2017）。 CRISPR / Cas9介导的基因校正在亨廷顿病患者衍生的诱导多能干中逆转表型异常细胞。干细胞报告 8（3）：619-633。