材料和试剂

玻璃幻灯片
纸巾
铝箔
塑料一次性滴管
手术刀
瓷砖
年轻的高粱植物
双蒸水
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
1 N盐酸（HCl）（见食谱）

设备

手术刀
镊子
马弗炉（Alfi实验室用品）
双目显微镜（Motic，型号：SMZ168系列）
光学显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse 80i）

程序

采样
1. 将需要估计硅石硅化水平的年轻植物（达1个月大）带到实验室。记录从外面可见的最年轻叶子的长度。
  注意：我们把这个最年轻，明显出现的叶命名为leaf-2（Kumar等，2017a）（图1）。
2. 在双目显微镜下，使用手术刀和钳子，将老叶子从叶子2上小心地取出。叶2然后沿着叶的长度切成10等份。
  
  图1.年轻高粱植物示意图叶子2用箭头表示。图由Kumar等人改编。（2017a），经John Wiley and Sons出版社许可。文章的原创作者和出版商保留这个图的版权。
波形图准备
1. 叶片2的片段平放在载玻片上。叶-2的基部段总是滚动的;因此将1-2滴双蒸水放在载玻片上并将该部分压在滴剂上。这样，该部分平坦，并坚持幻灯片。将一小块铝箔折叠2-3次，并保持在滑块的两个短边附近（图2）。将另一张新鲜的载玻片保持在载玻片的顶部，将样品固定在位。重复该步骤，直到所有的片段放在幻灯片上。所有的幻灯片保存在干净的瓷砖上，放入马弗炉中，在550℃下烧结3小时至过夜。关闭炉子并使其冷却至通常需要12小时以上的室温。
  注意：两张玻片之间的铝箔确保两张玻片在组织样本燃烧时不会相互接触。我们不会超过580°C，因为载玻片可能会开裂，变形，熔化或粘在一起。我们使用在房屋地板上使用的瓷砖。瓷砖作为一个坚实的基地，所有的幻灯片可以在一个基地放在一起。我们不会用记号笔在幻灯片上写任何东西，因为刻录会擦除所有标记。相反，在放样品燃烧之前，我们记下样品的名称及其相对于瓷砖的一侧的方向。燃烧三个小时足以定量评估叶子中的二氧化硅细胞硅化。
  
  图2.显示两个载玻片之间用于提供散点图的叶片2片段的图像
2. 带有烧焦的叶子材料的幻灯片放在纸巾上，不会打扰他们。使用塑料滴管，非常小心地轻轻地从玻片的一侧（图3）用约1-1.5ml的1N HCl洗涤灰。然后用约1-1.5ml双蒸水洗涤载玻片以除去HCl溶液和溶质。然后将两张玻片在室温下分离并干燥。
  注意：样品名称可以写在干燥的幻灯片上。
  
  图3.用1N HCl洗涤烧过的叶片2片段
数据采集
1. 载玻片干燥后，将底部载玻片（没有盖玻片）取到透射光显微镜，并在低倍放大（4倍）下目视扫描以寻找具有硅化细胞的区域。确定并选择载玻片上具有最长，不间断的二氧化硅细胞的区域用于数据采集。在一个方向上的二氧化硅电池行之后获得十个连续的图像。
  注意：所有用于数据分析的图像必须使用一个普通的高倍率目标来获取;否则数据将不统一。必须以这样的方式拍摄图像，即二氧化硅电池的行与屏幕的一侧平行。
2. 我们对所有图像使用20x物镜，所有图像的尺寸均为690 x 506μm。

数据分析

在图像的每一行中计数硅化硅石细胞的数量，仅考虑硅化硅石细胞数量最多的行进行数据分析。在二氧化硅细胞硅化过程开始时，只有二氧化硅细胞的边界看起来被硅化，并且在细胞图中只有细胞边界是轻微可见的。那些细胞也被算作硅化细胞。有时，在更为成熟的leaf-2片段中，许多二氧化硅细胞连接在一起形成多聚体。在这种情况下，三个叶片被认为是一个二氧化硅单元。我们用下面的例子来展示我们的方法（图4）。在这张人形图中，有三行二氧化硅细胞，上排（第一排）有八个二氧化硅细胞，中间一排（第二排）有七个二氧化硅细胞，而下排（排 - 3）有13个硅石电池。因此，该图像的硅化分数为13.对来自样品的十个连续图像中的每一个的硅化分数进行平均。平均数量成为该特定段的硅石细胞硅化状态。计算并比较不同部分的硅化分数。

图4.放大20倍的情况下的图像。二氧化硅细胞被虚线椭圆包围。比例尺=100μm。

食谱

1 N HCl
市售HCl的强度为12.1N。我们将8.26ml市售HCl加入到91.74ml双蒸水中，使HCl的终浓度为1N。

致谢

SK感谢以色列高等教育委员会规划和预算委员会的博士后奖学金。这项研究得到了以色列科学基金会534/14号的资助。作者声明，任何利益冲突或利益冲突都不存在。

参考

Kumar，S.和Elbaum，R.（2017）。高岭石细胞寿命期间二氧化硅沉积与生存能力之间的相互作用新Phytol 。
Kumar，S.，Milstein，Y.，Brami，Y.，Elbaum，M。和Elbaum，R.（2017a）。二氧化硅在高粱硅质细胞中的沉积机制 New Phytol 213（2）：791-798。
Kumar，S.，Soukup，M.和Elbaum，R.（2017b）。禾草中的硅化：不同细胞类型之间的变化 <前期植物科学< / em> 8：438。