材料和试剂

1毫升TB注射器（BD，目录号：309624）
1.7毫升微量离心管（VWR，目录号：490004-444）
0.2毫升PCR管（VWR，目录号：20170-012）
聚苯乙烯培养皿（Fisher Scientific，目录号：S33580A）
分体式橡胶塞（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：W224100-282）
20毫米铝封（DWK生命科学，惠顿，目录号：224178-01）
20mm E-Z卷曲机，标准密封（DWK Life Sciences，Wheaton，产品目录号：W225303）
20毫米的E - Z Decapper（DWK生命科学，惠顿，目录号：W225353）
聚碳酸酯离心管（Beckman Coulter，目录号：361690）
细胞分散器（Fisher Scientific，目录号：08-100-10）
10ml血清瓶（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：223739）
面罩，实验室外套和高压灭菌手套
纸巾
吨。 Kodakarensis株TS559（Santangelo等人，2010）
DH5α大肠杆菌感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：18258012）。
XL1-Blue大肠杆菌感受态细胞（Agilent Technologies，目录号：200228）
pTS700（Hileman和Santangelo，2012）
注：请联系相应作者获取质粒。
胍丁胺（Sigma-Aldrich，目录号：A7127）
元素硫（Aqua Solutions，目录号：S8800-12KG）
10mM Tris-HCl pH8.0（VWR，目录号：97061-258）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：190764）
LE快速溶解琼脂糖（VWR，目录号：490000-004）
溴化乙啶（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
AMPure XP（Fisher Scientific，目录号：NC9959336）
制造商：Beckman Coulter，目录号：A63880。
Nucleospin凝胶和PCR清理试剂盒（MACHERY-NAGEL，目录号：740609）
ZR质粒小量制备试剂盒（Zymo Research，目录号：D4015）
T4 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录编号：M0203）
dGTP（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：10297018）
SwaI限制酶（New England Biolabs，目录号：R0604）
dCTP（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10297018）
NEBuffer 2.1（新英格兰生物实验室，目录号：B7202S）
Taq DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0267）
dNTPs（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10297018）
700正向引物（5'CGCCGCAATAGCGGTCGTCGTCATGTTCCC 3'）
700反向引物（5'AACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACC 3'）
质粒小量制备组件
Quikchange II（安捷伦科技，产品目录号：200523）
Dpn I
Gelzan（Sigma-Aldrich，目录号：G1910）
Phusion DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530）
6-甲基嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：M1256）
注：此产品已停产。
多硫化物
苯酚（AMRESCO，目录号：0945）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
异戊醇（EMD Millipore，目录号：1009791000）
胰蛋白胨（EMD Millipore，目录号：1072131000）
注意：T. kodakarensis需要使用胰酶酶促消化的酪蛋白蛋白胨。胰蛋白胨的其他来源适用于大肠杆菌培养基。
酵母提取物（AMRESCO，目录号：J850）
注意：对于大肠杆菌培养基，任何酵母提取物都是合适的，但是T.kodakarensis需要这种酵母提取物来源。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：793566）
琼脂
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A0166）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1276）
生物素（AMRESCO，目录号：0340）
泛酸（Sigma-Aldrich，目录号：259721）
注：此产品已停产。
硫辛酸（Fisher Scientific，目录号：BP26821）
注：此产品已停产。
叶酸（Sigma-Aldrich，目录号：F7876）
对氨基苯甲酸（Acros Organics，目录号：146210010）
硫胺（Fisher Scientific，目录号：BP892-100）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R1706）
注：此产品已停产。
吡哆醇（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
钴胺素（Sigma-Aldrich，目录号：V6629）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（EMD Millipore，目录号：MX0070）
硫酸铵（（NH 4）2 SO 4）（VWR，目录号：BDH9216）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（EMD Millipore，目录号：CX0130）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
磷酸二氢钾（KH 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
溴化钠（NaBr）（Fisher Scientific，目录号：S255）
氯化锶六水合物（SrCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：13909）
注：此产品已停产。
硫酸亚铁铵（II）六水合物（Fe（NH4）2（SO4）2•6H） 2）（Sigma-Aldrich，目录号：F3754）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4•2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：M114）
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：202185）
七水硫酸锌（ZnSO 4）（RICCA Chemical，目录号：RDCZ0200）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4•5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C8027）
十二水合硫酸铝钾（AlK（SO 4）2•12H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：A605）
硼酸（H 3 BO 3）（Fisher Scientific，目录号：A73）
脱水钼酸钠（Na 2 MoO 4•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S6646）
注：此产品已停产。
硫化钠九水合物（Na 2 S•9H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：431648）
半胱氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP377）
谷氨酸（AMRESCO，目录号：0421）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：W328707）
精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5131）
脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：W331902）
天冬酰胺（AMRESCO，目录号：94341）
组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H8000）
异亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：W527602）
亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8000）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5626）
苏氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8625）
酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T3754）
丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：W381829）
甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2126）
丝氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：S8407）
注意：此产品已停产
色氨酸（AMRESCO，目录号：E800）
天冬氨酸（AMRESCO，目录号：0192）
谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G3126）
缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V0500）
苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（见食谱）
LB板（见食谱）
LB-Amp板（见食谱）
KOD维生素（见食谱）
ASW-YT媒体（见食谱）
2x ASW解决方案（请参阅食谱）
微量矿物质溶液（见食谱）
多硫化物（见食谱）
0.8x ASW解决方案（请参阅食谱）
20氨基酸溶液（见食谱）

设备

Eppendorf微量离心机5424（Eppendorf，型号：5424）
125ml血清瓶（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：223748）
面锅
高压灭菌器
厌氧室（Coy Labs）
玻璃培养皿（VWR，目录号：89000-304）
注意：在这里使用玻璃培养皿，因为很多塑料培养皿在温度为85℃的温度下融化。
Beckman Avanti J系列离心机系统
JLA10.500转子（Beckman Coulter，型号：JLA10.500，目录号：369681）
Eppendorf Mastercycler Nexus热循环仪（Eppendorf，目录号：6333000022）
GasPak EZ Anaerobe容器系统（BD，型号：GasPak TM EZ，目录号：260678）
移液器（Gilson，产品目录号：F123600，F123615，F123602）
酶冷却器，等温线系统（Eppendorf，型号：IsoTherm-System 开始集，目录号：3880000011）
VWR强制通风培养箱（37°C和85°C）
Thermo MaxQ 4000台式轨道摇床（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，Model：MaxQ TM 4000）
干式加热器（VWR，目录号：12621-090）

软件

Primer3（Untergasser et al。，2007）

程序

入门设计
1. 构建缺失菌株的第一步是产生一种质粒构建体，该构建体将促进目的基因的缺失，在本文中将其称为我们的阿基米珠单克隆抗体烯（YFG）。必须将特定的扩增子插入普通的质粒骨架（pTS700，见下文），并且必须用特定的5'和3'序列（添加到产生扩增子的引物中）产生选择的扩增子以便于构建所需的质粒。引物设计首先通过鉴定我们的基因序列（YFG）的序列以及京都百科全书中相邻区域的序列基因和基因组（KEGG）数据库（Kanehisa et al。，2017）。 T。 kodakarensis 参考基因组是参赛作品T00226。
2. 复制编码YFG的正链序列，加上上游700个核苷酸和YFG下游700个核苷酸。通过用单个“N”取代YFG序列，结束上游700个核苷酸序列和YFG下游700个核苷酸序列。得到的1,401个核苷酸序列用作引物设计软件程序Primer3（Untergasser等人，2007）的输入序列。
3. 在Primer3中，设置参数以要求选择将从输入的1,401个核苷酸序列产生≥1200个核苷酸的扩增子的一对25个核苷酸的引物。每个引物应该具有57℃的最小T min，没有最大T min，40％-75％G / C和2个核苷酸的GC-3'末端钳。 Primer3通常会返回多个引物对，为了方便，我们选择第一对。这些算法衍生的引物足以扩增选择的扩增子，但必须修改以添加有助于插入到pTS700中的序列。
4. 向上游引物添加序列5'GGAGGTGAATTTC。这个新的引物（38个核苷酸）将被命名为001-XXXX，其中XXXX是基因编号。向下游引物添加5'GGTGAAGGATTTC，并将该引物命名为002-XXXX。
  注：添加到001-XXXX和002-XXXX引物的附加序列有利于使用Ligation（LIC），这是我们首选的克隆方法，如果使用不同的克隆方法，可以省略。

A-质粒构建
注意：构建A质粒不需要从T.kodakarensis基因组中删除基因。 A质粒作为构建基因，可以构建多个基因修饰构建体，包括添加亲和标签序列，基因的截短版本或基因内的等位基因变化。因此，如果基因的缺失是唯一期望的结果，则B-质粒构建（参见“用于B-质粒构建的诱变PCR”）是唯一必需的质粒，并且可以使用替代的克隆策略构建。例如，仅包含与YFG同源的上游和下游区域用于克隆的合成DNA片段的排序就足够了。

吨。使用上面设计的引物（001-XXXX和002-XXXX）制备柯萨奇病毒（Kodakarensis）菌株TS559基因组DNA，用于扩增感兴趣的基因。为了适当地接种新鲜的T培养物。在100毫升ASW-YT培养基（参见食谱）中加入1毫升培养基，100毫升1M胍丁胺，100微升KOD维生素（参见食谱）和0.2克硫，在厌氧条件下。将新接种的培养物在85℃下温育12小时，然后转化。使用1毫升注射器，删除1毫升的。 Kodakarensis TS559培养物并转移到1.7ml微量离心管中，并通过离心（9,000xg，在桌面离心机中5分钟）收集细胞。倒出上清液，将收获的细胞重悬于100μl10mM Tris-HCl pH 8.0中，然后加入50μl苯酚：氯仿：异戊醇（参见食谱）。剧烈混合后，通过离心（9,000xg，在台式离心机中5分钟）分离有机相和水相，将50μl上层水层等分至新鲜的1.7ml微量离心管中，所述离心管中含有50μl10 mM Tris-HCl pH 8.0。通过加入100μl100％异丙醇沉淀核酸。在旋转30分钟（9,000×g，台式离心机）之后，小心除去异丙醇，并使近无色的小核酸颗粒干燥10分钟。用30μl10 mM Tris-HCl pH 8.0重悬干燥的沉淀。用于PCR反应之前，DNA未被定量。
通常使用如上制备的含有3μl基因组DNA（〜300ng）的混合物（50-100μl）中的001-XXXX和002-XXXX引物实现PCR扩增。任何高保真DNA聚合酶都可用于PCR扩增，应按照生产商的建议使用。
为了确定是否产生感兴趣的扩增子，将〜5μl的扩增反应装载到1％琼脂糖凝胶中，溶解，用溴化乙锭（EtBr）染色，并成像。如果正确的产物被扩增而没有替代产物，则使用AMPure XP珠按照制造商的说明纯化得到的扩增子。如果鉴定了所需产物和替代产物的混合物，则应将总反应物加载到凝胶中，溶解，染色，成像，并将所需扩增子从凝胶中切出并使用市售凝胶纯化试剂盒如Nucleospin Gel和由Machery-Nagel按照制造商的说明进行PCR清洁试剂盒。
注意：凝胶纯化试剂盒或PCR清洁试剂盒可用作AMPure XP微珠的替代品。
在产生所需的YFG扩增子的同时，应制备质粒pTS700以接受扩增子。 pTS700是用于所有基因缺失构建体的载体，并含有E。大肠杆菌复制起点（ oriC ），Amp R 和 T。 kodakarensis可选和反选择标记TK0149和TK0664。 pTS700还具有用于通过LIC插入YFG扩增子的SwaI限制酶切割位点。 PTS700可以维护在任何标准的E。使用氨苄青霉素作为选择性标记的大肠杆菌菌株容易通过市售的小量制备试剂盒（我们通常使用ZR质粒小量制备试剂盒并遵循制造商的说明）从培养物中回收，并且通过荧光测定或光谱技术测定浓度。 />
此时，YFG所需的扩增子和pTS700应被纯化。 LIC将被用于再次构建新的质粒pCSUXXXXA，其中XXXX是YFG的基因编号。 LIC使用质粒和PCR产物之间的12个核苷酸互补突出端来驱动扩增子序列并入载体。通过载体和扩增子序列上的T4 DNA聚合酶（DNAP）介导的外切核酸酶活性产生互补性（图2）。
注：在A质粒构建中，LIC不是必需的。我们利用LIC进行质粒构建，因为它是构建T. kodakarensis基因组中所有2,306个基因的缺失质粒的最具成本效益的选择。 LIC不依赖于DNA连接酶或磷酸酶，唯一需要的酶是T4 DNAP（Aslanidis和de Jong，1990）。任何标准的克隆方法都可以用来代替LIC。

图2.使用不依赖于连接的克隆的A质粒的构建A.使用001-XXXX和002-XXXX引物扩增靶基因以及上游和下游序列，所述引物包括必需的5 '尾巴序列。将纯化的扩增子与T4DNAP和dGTP温育以产生12个核苷酸突出端。 B.使用SwaI消化pTS700，然后用T4DNAP和dCTP孵育以产生扩增子互补的12个核苷酸突出端。 C.T4 DNAP处理的扩增子和质粒一起温育并转化到E.大肠杆菌产生A质粒。

按照制造商的说明书，在20μl反应液中用500ml SwaI消化纯化的pTS700。在SwaI消化之后，加入1μl的T4DNAP和1μl的100mM dCTP，在37℃下继续孵育30分钟，然后在85℃下20分钟以热灭活所有的酶，最后将反应置于冰上。
同时，第二个反应将制备用于LIC的YFG扩增子。将最终体积为9μl的500ng所需扩增子，0.9μlNEBuffer2.1,0.5μl100mM dGTP和0.5μlT4 DNAP混合，在37℃孵育30分钟，然后在85℃孵育20分钟，以热灭活酶。将每个反应物的1μl等分部分合并在单一管中，加热至85℃3分钟，使混合物缓慢冷却至室温。这种缓慢冷却允许12个核苷酸的互补突出端退火。在冷却步骤之后，将2μl反应物转化到任何标准E的50μl感受态细胞中。大肠杆菌菌株，并铺在LB-Amp平板上（见食谱）。

过夜温育后，使用菌落PCR确定所得转化体是否含有新构建的所需A质粒。应使用pTS700特异性引物（700Forward和700Reverse）检查至少10个不同的菌落，尽管在某些情况下可能需要筛选额外的菌落。在0.2ml PCR管中将每个菌落从平板上挑取到6μldH 2 O中，并重新悬浮。取出4μl，点在LB-Amp平板上，在PCR管中留下2μl（确保PCR管上的标记与位置板上的标记匹配）。一旦发现所有的菌落，在37℃温育LB + Amp平板以允许过夜生长。剩余的2μl细胞将用作使用Taq DNAP的扩增反应中的DNA组分。 Taq DNAP产生最好的结果，因为它对转移到反应中的细胞和培养基组分不敏感。

菌落PCR条件（20μl）

Taq DNAP (20 U/μl)	0.1 μl
dNTPs (2.5 mM)	1.6 μl
10x ThermoPol buffer	2 μl
700Forward primer (100 μM)	0.1 μl
700Reverse primer (100 μM)	0.1 μl
Resuspended cells	2 μl
H2O	13.9 μl

PCR后，将总反应物装入1％琼脂糖凝胶中，溶解，染色并成像。如果LIC不成功，将会产生150bp的产物。如果LIC成功，则会出现150 bp的产物加上您的初始扩增子（YFG + 1,400 bp侧翼区域）的大小。鉴定成功的LIC产生的质粒之一，返回到斑点板，并将相应的菌落挑入5ml含有氨苄青霉素的LB中，并在37℃振荡培养过夜。从E纯化质粒。使用优选的质粒Miniprep试剂盒对其进行定量，并在两个单独的反应中使用700正向引物和700反向引物对整个扩增子进行测序。如果测序证实YFG连同上游和下游序列已被插入到pTS700中，则该质粒现在被命名为pCSUXXXXA并被称为A-质粒。

B质粒构建的致突变PCR
1. B质粒用于基因缺失，缺少YFG但保留上游和下游序列。为了构建B质粒，使用Quikchange-II反应与A质粒作为DNA模板。使用60个核苷酸的引物，引物与目的基因两侧的30个核苷酸结合，从而从最终产物中删除编码YFG的序列。前30个核苷酸应与YFG上游30个核苷酸相同，而3'端30个核苷酸应与YFG下游30个核苷酸相同。这些长引物确保引物具有足够的解链温度（> 78℃）。 Quikchange中使用的60个核苷酸的引物被命名为016-XXXX和017-XXXX，并且根据Quikchange的要求，引物是彼此的反向互补。
2. Quikchange反应的条件完全遵循Quikchange-II试剂盒方案，包括降解E的DpnI处理。大肠杆菌甲基化的A-质粒。在Dpn I处理后，用2μl总反应物转化50μlXL1-Blue E.coli。然后将其接种在LB-Amp琼脂平板上，并在37℃温育过夜。再次使用引物700Forward和700Reverse进行菌落PCR以确定编码YFG的序列是否从A-质粒中删除，仅留下现在融合的上游和下游序列。所有缺失的产物大小应为约1,400bp，并将对应于缺失的菌落挑入5ml LB-Amp中，在37℃温育过夜，并使用优选的质粒Miniprep Kit纯化新构建的B质粒DNA。所得纯化的B质粒在两个分开的反应中使用700正向和700反向引物进行测序。如果测序证明YFG已经被删除，那么这个新的质粒现在被命名为pCSU-XXXXB，并且将被用于构建T. kodakarensis缺失株。＆nbsp;
Thermococcus kodakarensis 转化
1. B质粒必须转化为T。 kodakarensis 菌株TS559。如步骤B1所述，转化的第一步是接种新鲜的TS559培养物。
2. 为了完成转化，将细胞分散到专门的板上，在85℃保持固态。用于制造盘子的介质必须在浇注之前立即进行高压灭菌。使用前不应超过24小时。两个100毫升独特成分的血清瓶分别高压灭菌，并立即混合，然后浇注。每套血清瓶将产生四块板，每次转化需要两块板。对于所有的平板，其中一个瓶子将保持一致，并含有1克Gelzan在50毫升蒸馏水中。一旦加入Gelzan和dH2O，用橡皮塞和铝密封盖上血清瓶并摇匀以充分混合。请注意，Gelzan在高压灭菌之前不会完全溶解。第二瓶的内容将根据所需固体培养基的组成而变化。初始转化所需的培养基是ASW-YT-S，因此第二个血清瓶将含有50ml含有0.5g酵母提取物，0.5g胰蛋白胨和500μl微量矿物质的2x ASW（见食谱）（见食谱）。所有的试剂都放在瓶子里后，用橡皮塞盖住，用铝密封圈密封。
  注意：把两个瓶子放在一个带有盖子的高压灭菌器安全的容器中，并在底部加入少量的水。为此，我们使用了一个大面条锅，但是任何带有盖子的大容器都可以工作。密封的瓶子在高压釜中存在爆炸危险。将瓶子放在大面条锅中，确保在极少数情况下会发生爆炸。使用密封的小瓶和高压灭菌器时，应采取适当的安全措施，包括使用面罩，实验室外套和高压灭菌手套。
  在121℃下进行20分钟灭菌的标准液体高压灭菌循环就足以消毒培养基并溶解Gelzan。一旦高压灭菌循环结束，取出面条罐，并将瓶子放入厌氧室。 Gelzan在85°C以下的任何温度下都会开始固化，并保持固化状态，因此在高压灭菌循环结束后，您必须立即倒入平板。对于每一组两个瓶子，四个以前高压灭菌的玻璃培养皿应布置在室内以便快速倾倒。一旦瓶子在室内，迅速打开装有2个ASW的瓶子，然后加入100μl维生素和200μl多硫化物（见食谱）。漩涡混合好，注意不要溅出。现在，盖上装有Gelzan的瓶子，将2个ASW瓶倒入Gelzan瓶中，再搅拌均匀。将大约1/4的瓶子倒入每个盘子。板应该在10秒左右。让平板冷却约10分钟，然后翻转平板直到准备使用。
3. 12小时后，将TS559液体培养基（100ml）置于厌氧室中，倒入适用于高速离心机的聚碳酸酯离心管中。将离心管密封，从室中取出，并在4℃下以18,000×g g离心10分钟在JLA10.500转子中旋转以沉淀细胞。离心后，立即取出并倒置离心瓶，使细胞沉淀不受上清液的干扰，同时将管移回到厌氧室。一旦管子回到室内，小心地取出上清液而不会干扰颗粒。
  注意：必须使用聚碳酸酯管，因为它们可以承受培养物的高温。
4. 将细胞沉淀重悬于3ml 0.8x ASW中（参见食谱）。每次转化只需要200μl重悬细胞，因此100ml培养物产生足够的细胞进行〜15次转化。重新悬浮后，从离心瓶中取出细胞，并将其置于冰上的1.7ml微量离心管中。
  注意：
  1. 为防止小室变湿，请使用带有盖子或酶冷却器的小冰桶。让细胞在冰上孵育30分钟。
  2. 细胞不能被储存用于未来的实验
5. 当细胞在冰上孵育时，制备先前纯化的B质粒用于转化。对于每个转化，将3μg纯化的B质粒等分到1.7ml微量离心管中，并将其带入室中。
6. 细胞在冰上孵育30分钟后，将200μl细胞加入到3μg质粒中。继续在冰上孵育60分钟。
7. 虽然 T。 kodakarensis 自然是胜任的，在转换协议中使用热冲击步骤来提高转换的效率。将细胞/质粒混合物加热至85℃1分钟，然后在冰上恢复5分钟。每个转化将分散在两个平板上，一个是高细胞体积（160μl），另一个是低细胞体积（40μl），使用细胞扩散器。铺展后，将板翻转倒置，放入金属圆筒中，用纸巾吸收水分，并用GasPak EZ Anaerobe容器系统包装袋保持生长期间的厌氧条件。将圆柱体密封在室中，从室中取出，并置于85℃的培养箱中48-72小时。
8. 让殖民地形成后，从培养箱中取出圆筒，并带入厌氧室。从圆柱体上取下平板，并确定 T。 kodakarensis 殖民地。殖民地小，清晰，难以辨认。由于这个原因，很难直接从转化平板挑选单个菌落，因此常常需要将菌落点出来。将至少10个菌落点在与转化板具有相同组成的培养基上。为了发现单个菌落，将来自转化平板的菌落挑取到6μl0.8x ASW中，并且连续稀释物被点样（点〜6μl）。使用0.8x ASW并在每个步骤中稀释10倍，将集落10个稀释物在新浇的平板上点出来。然后将培养皿置于带有厌氧菌包装的金属圆筒中，并在85℃下培养48-72小时。
9. 温育后，将平板从培养箱中取出并放入厌氧室。从每个连续稀释系列中的一个菌落被用于接种5ml补充有0.1g元素硫和5μlKOD维生素的ASW-YT。将这些新鲜接种的瓶子密封在厌氧室中，取出，并在85℃温育过夜。这些培养物将被称为潜在的中间株。过夜生长后，如步骤B1所述，从这些培养物中提取总基因组DNA。
中间品系的选择
1. 为了转化成功，由存在的活菌落表明，B质粒必须已经通过同源重组整合到基因组中。质粒有可能在感兴趣的基因的上游或下游的两个基因座之一重组（图3）。
  
  图3.使用PCR鉴定中间基因组使用特异于基因组序列的引物对B质粒（700Forward和700Reverse）特异性的引物鉴定中间基因组。对于中间PCR，不能使用靶基因的001和002引物;而应分别使用上游和下游基因的001和002引物。
  
  有必要通过PCR确认B质粒已经整合到基因组中并确定了这种重组的基因座。来自潜在中间株的纯化基因组DNA（如上述步骤D9中所述）将用于具有两种独立引物组合的PCR反应中：700正向与002-XXXY组合使用，而700反向将使用001-XXXW。使用3μl（〜300ng）的基因组DNA和Phusion DNAP按照制造商的说明进行PCR。 PCR反应在1％琼脂糖凝胶上分辨，染色并成像。理想情况下，上游和下游重组事件将在单个菌落中被鉴定，但是在某些情况下，只有一个重组事件被鉴定出来。
  注：此PCR中使用的引物001和002不是YFG，而是YFG上游和下游的基因。如果001和002引物对于相邻基因不可用，任何引物应该足够，只要它在感兴趣的基因的001和002引物的外部即可。感兴趣的基因的001和002引物不能使用，因为它们会结合质粒和基因组DNA序列。
2. 使用中间PCR的结果，选择两种不同的中间体，理想的是两种可能的重组事件中的每一种。每个选择的中间菌株用于接种5ml补充有5μlKOD维生素，元素硫和5μl1M胍丁胺的ASW-YT。此时加入胍丁胺，使得细胞不再有选择性的压力将质粒保留在基因组中，并允许发生第二次重组事件。这些培养物允许在85℃下生长12小时。
3. 为了选择已经自发切除了质粒序列并可能产生YFG缺失菌株的细胞，将中间菌株的过夜培养物散布在除了KOD维生素，多硫化物和20个氨基酸溶液之外还含有胍丁胺和6-甲基嘌呤的平板上（见食谱）。对于每个中间培养物，将倒出两块平板。如步骤D4所述，使用两个50ml的血清瓶。如前所述，一个血清瓶将含有在50ml H 2 O中的1g Gelzan。第二个血清瓶现在只含有50毫升的2x ASW和500微升的微量矿物质。使用相同的高压灭菌程序。从高压灭菌器中取出血清瓶并将其置于厌氧室中，打开含有2×ASW的血清瓶，并将100μl1M胍基丁胺，100μl100μM6-甲基嘌呤，200μl多硫化物和5ml 20个氨基酸溶液加入并充分混合。然后将该溶液加入含Gelzan的瓶中，充分混合，并倒入4个玻璃Petri板中。
4. 培养12小时后，将含有胍丁胺的确认的中间培养物放入培养室，在培养箱中将其分散到反选择平板上。用于每种培养物的两个平板将用于扩散高（160μl）或低（40μl）体积的细胞。对于每个平板，将正确数量的细胞移液到表面上并使用细胞铺展器将细胞铺展在平板周围。接下来，将板放入带有厌氧膜袋的金属圆筒中并密封。将圆筒从室中取出并置于85℃培养箱中48-120小时。
5. 温育85°C后，至少有10个扩散板的菌落必须点缀在与扩散板完全相同的新浇板上，以获得单菌落。为了发现单菌落，将铺展的菌落挑取到6μl的0.8x ASW中，并使用0.8x ASW进行连续稀释斑点铺板，并且在每个步骤中进行10倍稀释10步（斑点〜6μl ）。连续稀释点样后，将平板置于带有厌氧膜包装的金属圆筒中，并在85℃温育48-120小时。
6. 在这些斑点板被允许生长之后，使用来自每个连续稀释系列的一个菌落接种5ml补充有5μl1M胍丁胺，5μlKOD维生素和0.1g元素硫的ASW-YT。过夜生长后，如步骤B1所述，可从这些培养物中提取总基因组DNA。
确认删除株
1. 质粒在基因组中重组时可能发生两种可能的重组事件。一个重组将使基因型返回到保留YFG的亲本株，而另一个将产生具有期望的YFG缺失的基因组。如果在从至少2个中间体检查30个单独的菌落之后，理想地从每个可能的重组事件中观察到一个，则仅观察到野生型基因组，然后将该基因视为统计上必需的。进行一系列不同的PCR反应以确定YFG是否被删除（图4）。
  
  图4.确定所需的缺失菌株命名为“A”的引物是001-XXXX，命名为“B”的引物是002-XXXX。 C和D引物是感兴趣基因内部的任何引物。为了确认目的基因的缺失，必须使用至少3种引物组合，A / B，C / D和A / D或B / C。如果感兴趣的基因已从基因组中删除，则不会使用C和D引物合成产物。
  
  总是使用TS559基因组DNA作为最终PCR反应的阳性对照。第一次PCR使用001-XXXX和002-XXXX引物来确定YFG是否被删除，第二次PCR使用001-XXXX或002-XXXX和YFG内部的引物。第三个PCR反应使用完全在YFG内部的一对引物。第二和第三反应的PCR产物的缺乏表示只要产物使用对照TS559基因组DNA存在就发生了删除。这些PCR反应使用高保真DNAP和3μl基因组DNA（〜300ng）进行。 PCR后，使用1％琼脂糖凝胶分离产物，用EtBr染色，并成像。
2. 如果在最终的PCR扩增中鉴定出期望的缺失基因组，则对该菌株进行进一步的扩增以扩大YFG真正被删除的置信度。使用Phusion DNAP和3μl纯化的基因组DNA（〜300ng）在50μl反应中重复使用001-XXXX和002-XXX引物的外部PCR。 PCR后，只有5微升这个反应用于琼脂糖凝胶确认PCR工作。剩下的反应被送到DNA测序设备进行纯化和测序，使用001-XXXX和002-XXXX引物在两个独立的序列反应中进行。
3. 一旦测序确认了YFG的缺失，构建了缺失菌株。如果需要，可以进行Southern印迹或全基因组测序以进一步确认删除。

数据分析

质粒构建确认
A和B质粒的构建通常是一个简单的程序，几乎没有问题。并发症可以由引物设计错误或引物不相容性引起，当发生这种情况时，使用程序选择的第二组引物通常足以解决任何问题。在LIC不成功的情况下，可以使用输注克隆（遵循制造商的说明）。使用所述方案，pCSU-0556A和pCSU-0556B的构建是典型的和无问题的。
中间应变PCR
对于中间菌株的PCR可能仅仅为其中一个引物对（001-XXXX / 700Reverse或002-XXXX / 700Forward）提供产物。在大多数情况下，PCR条件，退火温度或延伸时间的修改将允许使用两对PCR引物进行扩增。对于TK0556的缺失，使用标准PCR条件鉴定两种中间株（图5）。

图5.使用诊断PCR鉴定用于缺失TK0566的两种中间基因组。 X和Y泳道用于确定中间基因组的方向。在X反应中使用引物001-0565和700反向，而在Y反应中使用002-0567和700Forward。如果基因组是第一个中间产物，那么X产物应该是〜3600bp，而Y产物应该是〜1600bp。对于第二个中间产物，X产物应该是〜3600bp，Y产物〜3650bp。第三个对照PCR反应（Z）使用001-1418和002-1418进行以确保基因组制备产生适于PCR的DNA。预期的Z产品是〜1600 bp。
最终删除菌株PCR
理想情况下，除DNA测序之外，还将使用四种PCR反应来确定感兴趣的基因是否从T中删除。 kodakarensis TS559基因组（图6）。使用目的基因内部的两个引物进行的PCR反应对于确保该基因从基因组中被删除以及未经由脱靶重组事件而移动到不同的基因座是至关重要的。

图6.诊断PCR证实了从T中删除了TK0566。 kodakarensis 基因组。在TS559基因组上使用相同的引物对作为缺失基因组。使用引物A / B的大小移位对应于TK0566的缺失，而使用C / D和E / F的反应的产物不存在确认该基因已从其天然位点删除。使用引物C / D缺乏产物证明TK0566不存在于缺失菌株基因组的任何地方。

食谱

苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
25毫升Tris饱和苯酚
24毫升氯仿
1毫升异戊醇
LB媒体（1升）
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
注意：必须高压灭菌
LB-Amp板（1 L）
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
15克琼脂
注意：必须高压灭菌
KOD维生素（200x）（1升）
0.2克烟酸
0.08克生物素
0.2克泛酸
0.2克硫辛酸
0.08克叶酸
0.2克对氨基苯甲酸
0.2克硫胺素
0.2克核黄素
0.2克吡哆醇
0.2克钴胺素
注：此解决方案对光线敏感，应受到保护。
ASW-YT媒体
人造海水介质补充：
0.5％（w / v）胰蛋白胨
0.5％（w / v）酵母提取物
1x微量矿物质溶液
1x维生素混合物
1x人造海水含有（1 L）：
20克氯化钠
3克MgCl 2•6H 2 O 0 6克MgSO 4•7H 2 O 1克（NH 4）2 SO 4
200毫克NaHCO 3•/ 2 300毫克CaCl2•2H2O 2 O. 0.5克KCl
420mg KH 2 PO 4 4 50毫克NaBr
20mg SrCl 2•6H 2 O 10毫克Fe（NH4）2（SO4）2•6H2 / 2 > O
注意：必须高压灭菌
2x ASW（1 L）
40克NaCl
6克MgCl 2•6H 2 O 0 12克MgSO 4•7H 2 O 2克（NH 4）2 SO 4
400毫克NaHCO 3•/ 2 600毫克CaCl 2•2H 2 O 0 1克KCl
840毫克KH 2 PO 4
100毫克NaBr
40毫克SrCl 2•6H 2 O 0 20mg Fe（NH4）2（SO4）2•6H2 / 2 > O
微量矿物质（1,000x）（1L）
0.5克MnSO 4•2H 2 O 0.1克CoCl 2•6H 2 O 0 0.1克ZnSO 4•7H 2 O 0.01克CuSO 4•5H 2 O 0 0.01克AlK（SO 4）2•12H 2 O O 0.01克H 3 BO 3 3 0.01克Na 2 MoO 4•2H 2 O O 3 / O
多硫化物
10克Na 2 S•9H 2 O，每15克3克硫磺。
用热量溶解混合物
注意：当硫磺和硫化钠都完全溶解时，应该是深红色。
0.8X ASW（1 L）
16克NaCl
2.4克MgCl 2•6H 2 O 0 4.8克MgSO 4•7H 2 O 800毫克（NH 4）2 SO 4 4/2 160毫克NaHCO 3•/ 2 240毫克CaCl 2•2H 2 O 2 400毫克氯化钾
336mg KH 2 PO 4 4 40毫克NaBr
16mg SrCl 2•6H 2 O 8mg Fe（NH 4）2（SO 4）2•6H 2 / sub > O
注意：必须高压灭菌
20氨基酸溶液（1 L）
1克半胱氨酸
1克谷氨酸
1克甘氨酸
500毫克精氨酸
500毫克脯氨酸
400毫克天冬酰胺
400毫克组氨酸
400毫克异亮氨酸
400毫克亮氨酸
400毫克赖氨酸
400毫克苏氨酸
400毫克酪氨酸
300毫克丙氨酸
300毫克甲硫氨酸
300毫克苯丙氨酸
300毫克丝氨酸
300毫克色氨酸
200毫克天门冬氨酸
200毫克谷氨酰胺
200毫克缬氨酸

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（GM 100329）和能源部（004010-00002）对TJS的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

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