材料和试剂

15 ml离心管，RNase- / DNase-free（Corning，目录号：430791）
1.5毫升透明微管（Corning，Axygen ，产品目录号：MCT-150-C）
塑料组织研磨机杵（天根生物，目录号：OSE-Y001）
移液器的尖端10微升，100微升和1000微升（Eppendorf，目录号码：3120000020,3120000046和31200000623）
PVDF Western印迹膜（Sigma-Aldrich，目录号：03010040001）
注意：目前它是'默克，目录号：03010040001'。
超厚印迹纸滤纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703965）
96孔ELISA微孔板（Greiner Bio One International，目录号：650001）
胶粘剂
25 G⅝至30 G½规格的针头
Drummond替代玻璃毛细管，100 /小瓶（Drummond Scientific，目录号：3-000-203-G / X）
Parafilm M（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
注意：目前它是'默克，目录号：P7793'。
昆虫载体（ Laodelphax striatellusi ，Fallen）（从中国江苏省海安市的田间种群收集）
用引物5'-ATGGGTACCAACAAGCCAGC-3'和5'-CTAGTCATCTGCACCTTCTG-3'扩增RSV cp基因。在ProFlex TM PCR系统上在95℃的循环条件下进行PCR 5分钟，然后进行30个循环的95℃20秒，50℃30秒和72℃ 30秒将纯化的969bp的PCR产物克隆到pET-28a（Merck，Novagen，目录号：69865-3）中以进行Cp蛋白表达。将重组质粒送到北京基因组研究所进行单克隆抗Cp抗体生产。
寄主植物（Oryza sativa L。spp。 japonica var。Nippobare ）
注：健康的2周龄水稻叶片长约15厘米，用于显微注射。
蛋白上样缓冲液（5x）（Adipogen International，目录号：AG-10T-0020-L001）
ExpressPlus TM PAGE凝胶，4-20％（GenScript，目录号：M42010）
PageRuler TM预染蛋白梯度，10至180kDa（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：26616），用于SDS-PAGE
HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310-100），用于SDS-PAGE
EMPLURA甲醇（Merck，目录号：822283）
ELISA包被缓冲液，1x（Solarbio，目录号：C1050）
SuperSignal TM West Femto最大灵敏度底物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：34095）
山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗HRP（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：32430）
抗Cp抗体（北京基因组研究所）
用于ELISA的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统（Sigma-Aldrich，目录号：T0440）
注意：目前是“默克，目录号：T0440”。
用于ELISA的硫酸（H 2 SO 4）（5N）（Merck，目录号：480364）
十二烷基硫酸钠（SDS）（AMRESCO，目录号：0227），用于ELISA
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410）
注意：目前是'默克，目录号：M8410'。
Tween 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH7.4，碱性（1x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010031）
Oxoid TM脱脂牛奶粉（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：LP0031B）
吐温20磷酸盐缓冲液（1x）（PBST）（见食谱）
传输缓冲区（见食谱）
阻塞缓冲区（见食谱）
稀释的单克隆抗Cp抗体（见食谱）
稀释山羊抗鼠IgG，HRP结合抗体（见食谱）

设备

TGrinder高速组织研磨机（天根生物科技，目录号：OSE-Y30）
离心机5424R（Eppendorf，型号：5424 R）
用于ELISA和Western印迹的抗体孵育的脱色轨道振荡器（T-Bota Scietech Instruments＆amp; Equipment，型号：TS-200）
化学发光成像系统（Tanon，型号：Tanon 5200）
SpectraMax™Paradigm®多模式检测平台（Molecular Devices，型号：SpectraMax Paradigm Multi-Mode）
微管拉拔器（萨特仪器，型号：P-97）
ProFlex TM PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：ProFlex TM 3×32-Well PCR System，目录号：4484073 ）
用于飞虱孵化的玻璃培养箱（Φ55×150mm，Φ110×150mm）
注：每个玻璃培养箱都必须用尼龙网密封，以保护培养的植物或昆虫免受其他干扰源的侵害。培养条件是25°C，每天光照16小时（图1）。

图1.植物培养和昆虫饲养小褐飞虱和水稻幼苗在用尼龙网密封的玻璃培养箱中培养。有毒或无毒的飞虱在地理上是分离的，在不同的昆虫中培养。
MixMate ®，三合一搅拌器（Eppendorf，产品目录号：5353000014）
H 2 O 3干浴（Coyote Bioscience，型号：H 2 O 3 -10℃） >
PowerPac TM通用电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645070）
Trans-Blot TM Turbo TM转移系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704150）
Nanoject II可编程纳升注射器（世界精密仪器公司，型号：Nanoliter 2000）
Nanoject II自动纳升注射器回填针，2“长（Drummond Scientific，型号：3-000-027）
SZ61立体显微镜（Olympus，型号：SZ61），用于显微注射

程序

RSV粗提取物的制备
1. 对于RSV提取，使用100〜200个全毒的小褐飞虱作为样本。
  注意：昆虫应该直接收集。
2. 将病毒飞虱刷入15毫升的试管中，放在冰上2-3分钟以冻结。
3. 用TGrinder在800μlPBS缓冲液（pH7.2）（v：v，1：1）中充分研磨总飞虱，并将管保持在冰中。
  注：关于如何从昆虫载体中提取植物病毒的研究尚未见报道，而一些研究表明RSV感染的植物应在4℃的PBS缓冲液中提取（Ishikawa et al。，1982; Ishikawa et al。，1989）。所以在这项工作中，我们在相同的条件下研磨飞虱。
4. 彻底摇匀混合物至混匀，然后将试管置冰中30分钟。
5. 在4℃下将混合物在1,344×g下离心5分钟，并将上清液转移到1.5ml预冷的无RNA管中。
6. 重复步骤A5。
7. 在4℃下离心8,400×g 15分钟，并将上清液保存在4℃以备进一步使用。
  注意：上清液是RSV粗提物。
8. 使用相同的协议来分离非疣状小褐飞虱的粗提取物作为阴性对照。
  注：RSV粗提物和用于机械接种的非飞虱飞虱提取物应尽快显微注射到水稻叶中。
通过Western印迹检测RSV
1. 对于RSV检测，将20μl5x蛋白上样缓冲液与80μl来自毒性和非毒性飞虱的提取物混合，并将混合物煮沸5分钟。
2. 将20μl处理过的样品加入ExpressPlus TMPAGE凝胶的每个孔中，同时加入预染记号。
  注意：确保来自病毒和非病毒飞虱的处理样品不会交叉污染。
3. 在140 V运行凝胶40分钟。
4. 准备一个略大于凝胶尺寸的PVDF膜。
5. 将PVDF膜置于甲醇中5分钟。
6. 将PVDF膜和凝胶放入1x转移缓冲液中（参见配方）10分钟。
7. 准备转移三明治，并将其放置在25 mA的转印槽中30分钟。
  注意：转印三明治包括两端的一层滤纸，PVDF膜和凝胶。将PVDF膜置于凝胶表面和夹层中的正极之间。
8. 在室温（RT）下在TBST中的5％脱脂牛奶中封闭膜0.5-1小时。
9. 用PBST清洗膜（参见食谱）3次，每次5分钟。
10. 通过使用脱色轨道振荡器在室温下1.5小时或在4℃过夜孵育单克隆抗Cp抗体溶液中的膜（参见食谱）。
11. 重复步骤B9。
12. 通过使用脱色轨道振荡器在RT孵育HRP缀合的抗体溶液1.5小时。
13. 每次用PBST清洗5次，每次5分钟。
14. 根据制造商的说明使用西方Femto底物试剂盒进行印迹。
  注意：通过混合100μl稳定的过氧化物溶液和鲁米诺/增强剂溶液来制备工作溶液。使用100μl工作溶液/ cm 2膜。
15. 通过化学发光成像系统捕获化学发光信号。
  注：Cp只能从病毒性小褐飞虱的提取物中检测到（图2）。
  
  图2. RSV检测非疣状（1道）和含毒的（2道）小型褐飞虱的粗提取物。使用单克隆抗Cp抗体作为一抗。
RSV粗提取物的量化
1. 根据先前优化的标准ELISA方案（Nemzek等人，2001），在PBS缓冲液（pH7.2）中制备Cp标准品。进行9次稀释（0,0.0045,0.045,0.45,4.5,12.5,25,45,90ng / ml）。
2. 使用RSV粗提取物作为样品。
  注意：用于ELISA的样品应重复测试。
3. 加入100μl的标准品和样品到96孔ELISA板的每个孔中，并与100μl1x包被缓冲液混合。用粘性塑料盖住平板并在4℃下孵育过夜。
4. 每次用200μlPBST填充每个孔，每次至少洗3分钟，洗板3次。
5. 通过每孔添加200μl封闭缓冲液（参见食谱）来阻断孔中剩余的蛋白质结合位点。用粘性塑料盖住平板并在室温下孵育不少于30分钟。
6. 重复步骤C4。
7. 每孔加100μl稀释的单克隆抗Cp抗体。用粘性塑料盖住平板并在室温下孵育1.5小时。
8. 重复步骤C4。
9. 添加100μL稀释的山羊抗小鼠IgG，辣根过氧化物酶标记的抗体每孔（见食谱）。用粘性塑料盖住平板并在室温下孵育1.5小时。
10. 去除上清液，用PBST洗板5次，每次1分钟。
11. 向每个孔中分配100μl的TMB溶液。
12. 在室温下轻轻混合脱色轨道振荡器30分钟注意：这个反应应该避光。
13. 加入100μl2M H 2 SO 4或1％SDS以终止反应。
  注意：确保所有孔中的颜色从蓝色变为黄色。
14. 在5分钟内，在SpectraMax？Paradigm？多模式检测平台上读取450 nm的光密度（OD）。
  注意：您也可以读取显色反应后OD的吸光度值，而不添加终止溶液。 />
RSV在水稻叶片中的微量注射
1. 在Micropipette Puller上准备显微注射针（Dean，2006）（视频1）。
  注意：显微注射针是从玻璃毛细管中抽出的，25 G⅝到30 G½针针是注射的理想之选。
  
  视频1
2. 安装前用玻璃毛细管填充矿物油。
3. 用PBS缓冲液稀释RSV粗提物至约10ng / ml的Cp浓度。
4. 清空针头并用稀释的RSV粗提物填充。
  注：稀释后的RSV粗提物应置于石蜡膜上，然后吸入针中。
5. 使用Nanoliter 2000，将稀释的RSV粗提物微量注射到健康的2周龄水稻叶的中脉中，缓慢通过玻璃针5次，每个注射位点之间的间隔为1cm（视频2）。
  叶子的两面都可以进行微量注射注意：显微注射时应观察到中脉充满了RSV粗提物（图3）。
  
  图3. RSV显微注射和症状观察A. RSV显微注射。通过Nanoliter 2000将RSV粗提物显微注射到水稻叶中部。红色箭头指示注射部位。两周后观察接种了来自非疣绿飞虱（B）和病毒飞虱（C）的稻叶的症状。
  来自病毒性飞虱的RSV提取物引起典型的疾病症状
  视频2
6. 微量注射从非疣状小褐飞虱到健康稻叶中部作为阴性对照。
  注：阴性对照非常重要，因为它可以告诉你实验系统是否工作。
7. 在接种后约2-3周后评估注射叶和全身叶的疾病症状的发展。按照鸟山（Toriyama）和樱井（Sakurai）（1969）的描述评估疾病症状。
  注意：至少重复三次，每组至少包含30个幼苗。在中脉显微注射昆虫来源的RSV粗提物后，机械传播的RSV发生率约为17％。

数据分析

计算ELISA结果

计算每组标准品和样品的OD值或OD值的平均值。
注意：在这个实验中，在发色反应之后，不添加终止溶液，测量OD 630。
建立一个标准曲线，绘制从每个标准获得的平均OD值与线性方格纸上的ng / ml的浓度。 X轴显示标准蛋白质的浓度，Y轴显示相应的吸光度值（图4）。
根据标准曲线，用平均OD值确定每个样品的相应浓度（ng / ml）。
将衍生浓度乘以稀释倍数，以确定RSV粗提物样品中Cp蛋白的实际浓度。
注意：确保样品被适当稀释，其OD值在标准曲线范围内。

图4.使用CurveExpert 1.4进行ELISA结果的数据分析。：一种。数据输入。 Cp和OD 630值的浓度被列为X和Y轴。 B.标准曲线结构。标准曲线是基于数据图建立的。 S和r值被列在右上角。 C.标准曲线的方程。等式自动计算。这些参数在右侧窗格中列出。

笔记

建议在ELISA和显微注射步骤中，健康昆虫样品的提取应作为阴性对照，以评估实验系统。
来自非疣状或病毒性飞虱的RSV粗提物在4℃下储存不超过两天。通常，OD值高于1.00（Cp浓度约10ng / ml）的RSV粗提物适用于显微注射。

食谱

吐温20磷酸盐缓冲液（1x）（PBST）
0.2％吐温20
加入PBS缓冲液（pH7.2）
使用过滤设备过滤消毒
转移缓冲液（半干）
48 mM Tris
39 mM甘氨酸
20％甲醇
0.04％SDS
阻塞缓冲区
1或5％的脱脂牛奶
添加到TBST缓冲区
充分混合并过滤

在4°C下保存不超过3天
稀释的单克隆抗Cp抗体
将5μl单克隆抗Cp抗体加入10 ml封闭缓冲液（5％脱脂牛奶）中

在4°C储存不超过1天
稀释山羊抗小鼠IgG，HRP标记的抗体

加入2μl单克隆抗Cp抗体到10 ml封闭缓冲液（5％脱脂牛奶）中
在4°C储存不超过1天

致谢

这项工作是从以前发表的文章（赵等人，2016年）改编。我们承认中国科学院战略重点研究计划（XDB11040200）和国家重大基础研究发展计划（973计划）（No. 2014CB13840402）资助。作者声明没有利益冲突。

参考

Dean，D.A。（2006）。通过显微注射法制备（拉动）基因递送针 CSH Protoc 7。
Hogenhout，S.A.，Ammar el，D.，Whitfield，A.E。和Redinbaugh，M.G。（2008）。昆虫媒介与持续传播的病毒的相互作用 Annu Rev Phytopathol 46：327-359。
Ishikawa，K.，Omura，T。和Hibino，H。（1982）。水稻条纹病毒的特征是一种携带传染性的重组分。
Ishikawa，K.，Omura，T。和Tsuchizaki，T。（1989）。双链和单链RNA与水稻条纹病毒。 Jan J Phytopathol 55：315-323。
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Louie，R.U.（1995）。用于玉米白线花叶病毒等机械传播的玉米籽粒的血管穿刺玉米病毒。（ARS，玉米和大豆研究部，Wooster）。
Nemzek，J.A。，Siddiqui，J。和Remick，D.G。（2001）。使用商业抗体对开发和优化细胞因子ELISA。免疫学方法 255（1-2）：149-157。
Okuyama，S.和Asuyama，H.（1959）。水稻条纹病毒在水稻上的机械传播。 Ann PSJ 24：35.
Toriyama，K.和Sakurai，Y。（1969）。培育抗条纹病毒病的水稻品种 Jpn Agr Res Q 4：5。
Zhao，W.，Yang，P.，Kang，L.和Cui，F。（2016）。来自昆虫载体和病毒植物的水稻条纹病毒的不同致病性新Phytol 210（1）：196-207。