材料和试剂

注：除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich。

移液器提示
培养皿
无尘Nexterion玻璃幻灯片（肖特）
野生型线虫（N2布里斯托尔）线虫
大肠杆菌 OP50细菌
聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH，分子量〜17.5kDa）（Sigma-Aldrich，目录号：283215）
聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS，分子量约70kDa）（Sigma-Aldrich，目录号：243051）
线虫生长培养基（NGM）（bioWORLD，目录号：30620040-1）
线虫裂解液（2％NaOCl水溶液/0.45M NaOH）
次氯酸钠（NaClO）（Sigma-Aldrich，目录号：425044）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
盐酸左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：L9756）
戊二醛（25％水溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
通过Simplicity（Millipore）水净化系统纯化的超纯水（类型1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：NIST200B）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：71649）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：793612）
M9缓冲水溶液（见食谱）

设备

移液器（机械Eppendorf或吉尔森移液器）
Eppendorf Scientific Excella E24温控台式摇床（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Excella E24）
Biosan V-1 plus涡旋（Biosan，型号：V-1 plus）
尼康SMZ 745 T立体显微镜（尼康，型号：SMZ745T）
尺寸FastScan生物原子力显微镜（布鲁克，型号：Dimension FastScan）配备液体潜入式扫描仪
注意：不要使用空气扫描仪扫描液体，这可能会损坏仪器。
Biosan Microspin 12离心机（Biosan，型号：Microspin 12）
ScanAsyst-Fluid探针（标称长度70μm，尖端半径20nm，弹簧常数0.7N m -1）（Bruker，型号：SCANASYST-FLUID）注意：也可以使用Bruker或其他生产商提供的其他AFM探头，这些探头经批准可以在PeakForce Tapping模式下使用，其特性类似于ScanAsyst-Fluid探头。

软件

NanoScope原子力显微镜操作软件（布鲁克公司）
NanoScope分析v.1.7。软件（布鲁克公司）

程序

制备逐层（LbL）聚电解质涂覆的玻璃基材
1. 准备5毫克ml-1 PAH和PSS聚合物水溶液（每个5毫升）。
2. 将50μlPAH溶液滴在无尘载玻片的中心部位，在加湿室中孵育20 min（任何密封的玻璃或带有湿棉垫的塑料容器都可能用于防止过早蒸发）次与水。
3. 使用PSS解决方案重复相同的操作
4. 重复步骤A2和A3，直到得到的涂层结构为（PAH / PSS）12 PAH（连续12个PAH / PSS双层，然后是最终的PAH层）。最外面的聚电解质应该是PAH以确保沉积膜的正电荷。有关制造LbL薄膜的更多信息可以在别处找到（Lvov等人，1995）。
秀丽隐杆线虫线虫种植
1. 培养野生型C.根据标准方案（Brenner，1974），使用恒温振荡器，在20℃下，在NGM补充的琼脂平板上的线虫（N2布里斯托尔）线虫。使用大肠杆菌 OP50细菌喂食蠕虫。
  使用立体显微镜观察动物48小时后检测妊娠线虫
2. 用M9缓冲液（见食谱）将成年妊娠的成熟雌雄同体洗净并放入离心管中，离心2分钟（1100微克/克，适用于卵，幼虫和成年雌雄同体）收获。使用2％NaOCl /0.45M NaOH水溶液（4.5ml）溶解动物以获得线虫卵。用M9缓冲液洗蛋几次，然后如上所述通过离心收集并置于无菌NGM琼脂平板上。
3. 在20℃培养线虫以获得同步的成年雌雄同体。或者，培养蠕虫的时间较短，以获得幼虫动物（Brenner，1974）。
4. 收集步骤B2中所述的线虫。安乐死收集的蠕虫与45毫米左旋咪唑盐酸盐水溶液。用水洗净。
5. 使用2毫升缓冲戊二醛（在M9缓冲液中）在25°C固定动物2小时，然后用水洗。
原子力显微镜设置
1. 假定AFM操作员熟悉AFM的工作原理，并且具有Dimension FastScan Bio AFM的先前经验。有关引入PeakForce攻丝AFM模式的信息，请参阅显微镜手册或以下出版物（Durkovic ，2014）
2. 在样品准备好成像之前应该启动AFM（见下文）。理想情况下，这些步骤应该同时进行。
3. 打开显微镜和操作软件。
4. 根据制造商的手册安装并校准探头（ScanAsyst-Fluid）的机械特性。开始在空气中校准，然后在水中重复。
原子力显微镜成像
1. 放置液滴（100微升）的水悬浮固定线虫到LbL涂层载玻片上。
2. 等待30分钟沉降并将动物附着在LbL聚电解质膜上。
3. 通过移液将玻璃表面多余的水分移除，然后用水清洗玻片3次，以除去任何松散固定的蠕虫。
4. 在保留蠕虫的LbL沉积膜的顶部添加200μl水。
  在AFM成像之前，使用立体显微镜可以检查动物与载玻片的粘附
5. 使用真空抽吸将载玻片固定在显微镜台上。这应该小心，以避免从载玻片上的液体。
6. 使用内部AFM光学相机找到蠕虫。蠕虫会出现在连接到AFM内部摄像头的电脑屏幕上，就像在立体显微镜下看到的那样（图1）。
  
  图1.在支撑膜上固定线虫。显示成年人C的固定的草图。（PAH / PSS）12 PAH LbL沉积膜上的线虫（elegans）线虫和随后在液体（A）中的AFM成像。光学显微镜照相机快照显示AFM探针接近固定化C的头部（B），身体（C）和尾部（D）区域。线虫成年雌雄同体
7. 将探头放置在蠕虫的某个区域（即，头部，尾部或身体区域）。
8. 接近尖端的表面。使用相对较低的扫描分辨率（即，64行）来定位角质层表面。
9. 定位感兴趣区域（ROI）后，降低扫描频率（0.8-0.9 Hz）和峰值力设定值（1 nN）;增加扫描分辨率（最多512行）。典型的成人AFM图像。线虫线虫如图2所示。
  
  图2. PeakForce拍摄成人的AFM图像（PAH / PSS）12 PAH LbL沉积膜：尾部区域（上部行）和体部区域（下部行）上的线虫线虫。 A和D高度传感器地形图像; B和E.峰值误差图像; C和F.高度传感器数据的三维渲染，叠加峰值误差数据。
10. 在以下通道中采集图像：高度传感器，峰值力误差，附着力和Sneddon模量模式。图3演示了在所有四个通道中获得的图像。
  
  图3. PeakForce攻击L1幼虫（A）和成虫C的AFM图像。线虫（B）在地形（高度传感器），峰值力误差，粘附力和模量（Sneddon模型）通道中在水中成像的线虫。比例尺=1μm。
11. 可以使用更高的纵横比（即，5-6）来获得扫描，这允许增加图像的经度（比较图2和图3中的纵横比）。
12. 对于统计学显着的定量评估，检查5-10个人随机选择的线虫。
原子力显微镜原始数据处理
1. 将原始数据文件导出到NanoScope分析软件。
2. 打开一个文件，然后使用3 d 拼合顺序来平整图像。
3. 使用“相对于最小数据光标的色条刻度”功能调整色标
4. 使用Journal Quality Export功能导出高分辨率的tiff文件。
5. 对于高级图像处理和纳米机械表征，请参考NanoScope分析软件操作手册。

食谱

M9缓冲区
22 mM KH 2 PO 4 4 42mM Na 2 HPO 4 4 85.5 mM NaCl
1mM MgSO 4

致谢

这项研究是根据喀山联邦大学俄罗斯政府竞争力增长计划进行的。作者承认RFBR 17-04-02182授予。该协议是根据我们以前的出版物（Fakhrullina et。，2017）改编的。我们感谢E. Dubkova女士的技术帮助。作者没有利益冲突。

参考

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