材料和试剂

乙醇
乙酸
Histoclear（也称为CitriSolv）（Thermo Fisher Scientific，目录号：5989-27-5）
DEPC H 2 O
75％（v/v）乙醇和25％（v/v）乙酸（参见Recipes）
在H 2 O或组织清蛋白中的乙醇溶液的梯度系列（参见配方）

设备

显微镜
切片机（Waldorf，型号：HM310）
Pix-Cell IIe LCM系统（Arcturus）
无核糖酶玻璃载玻片
15μm激光束

程序

水稻胚胎的冷冻保护，固定和脱水
1. 从显微镜下的种子解剖水稻胚胎。
2. 将样品立即固定在含有75％（v/v）乙醇和25％（v/v）乙酸的固定溶液中的冰上。将样品在4℃下放置在小瓶中过夜。
3. 在一系列乙醇浓度（v/v）中依次将组织脱水70％，85％，95％，100％，在室温下各洗涤1小时，接着用乙醇：组织清洗（3:1，v/v ），然后用乙醇：组织清蛋白（1：1），乙醇：组织清蛋白（1：3）和100％组织清蛋白处理1小时。
4. 孵育脱水的样品在组织培养物中过夜，60度，然后用石蜡60度浸润2天，每12小时用石蜡替代组织透明液。
5. 在石蜡包埋后，用旋转切片机切成7μm厚切片的胚，并放置在无核糖酶的玻璃载玻片上，并在具有干燥剂的脱水条件下在4℃的黑暗中储存。
6. 将组织切片中的切片在室温下进行两次变化10分钟，并在LCM之前风干。
LCM
1. 使用Pix-Cell LCM系统进行激光捕获显微切割。脱蜡和干燥组织后，激光捕获显微解剖感兴趣的细胞，根据制造商的说明。
2. 基于细胞大小直径，使用15μm激光束分离胚器官细胞类型，激光功率设置为100mW，并且激光脉冲持续时间为2.5ms。通过比较捕获之前组织的图像之间的差异，移除收获的细胞后的组织的图像和捕获在帽上的细胞的图像，成功地鉴定了胚器官细胞类型并从异源组织中除去。通常，每个LCM帽处理5至8个载玻片，使用Post-It注释从LCM帽除去非特异性组织。见下图。

食谱

75％（v/v）乙醇和25％（v/v）乙酸
梯度系列H 2 O或乙醇溶液中的乙醇溶液

致谢

该协议改编自Kerk等人（2003）和Jiao等人（2009）。

参考文献

Jiao，Y.，Tausta，S.L.，Gandotra，N.，Sun，N.，Liu，T.，Clay， Ceserani，T.，Chen，M.，Ma，L.，Holford，M.，Zhang，H.Y.，Zhao， Deng，X.W。和Nelson，T。（2009）。水稻细胞类型的转录组图谱揭示细胞，功能和发育层次。 Nat Genet 41（2）：258-263。

Kerk，N.M.，Ceserani，T.，Tausta，S.L.，Sussex，I.M.and Nelson，T.M。（2003）。从植物组织激光捕获显微解剖细胞。植物生理学 132（1）：27-35。
Nelson，T.，Tausta，S.L.，Gandotra，N.，and Liu，T。（2006）。植物组织的激光显微切割：您所看到的是您所获得的。 Annu Rev Plant Biol 57：181-201