材料和试剂

BD 21 G针（Fisher Scientific，目录号：14-823-55）
制造商：BD，目录号：305274。
BD结核菌注射器（Fisher Scientific，目录号：14-823-2F）
制造商：BD，目录号：309602.该产品已停产。
TipOne 10μl移液管提示（USA Scientific，目录号：1111-3200）
TipOne 1-200μl天然吸头（USA Scientific，目录号：1111-1800）
TipOne 1000μl天然吸头（USA Scientific，目录号：1111-2020）
Costar 6孔细胞培养板（Fisher Scientific，目录号：07-200-80）
制造商：Corning，目录号：3506。
1.5ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：14-666-318）
Iscove修改DMEM（Mediatech，目录号：10-016-CV）
吐温40（CHEM-IMPEX INTERNATIONAL，目录号：01513）
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（MP Biomedicals，目录号：091860454）
1x胰蛋白酶-EDTA（Mediatech，目录号：25-051-Cl）
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0（Fisher Scientific，目录号：BP2482-500）
10％十二烷基硫酸钠（SDS）（Mediatech，目录号：46-040-Cl）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EO0491）
核糖核酸酶A，无DNA酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EN0531）
醋酸钾（Fisher Scientific，目录号：P171-500）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-500）
乙醇70％（Fisher Scientific，目录号：BP82011）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录：S318-500）
SYBR Green PCR Master混合物（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4309155）
氯化镁（MgCl 2）（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S3-500）
Tris-HCl缓冲液pH 7.4（Lonza，目录号：51237）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P330-500）
NP-40 10％溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：28324）
1 M MgCl 2（见配方）
2.5 M蔗糖（见食谱）
TMK（见配方）
TMK + 1％NP-40（见配方）
S1缓冲（见配方）
S2缓冲区（见配方）
细胞裂解缓冲液（参见食谱）

设备

通风微量离心机（Fisher Scientific，型号：accuSpin TM Micro 17R，目录号：13-100-676）
Gilson PIPETMAN经典移液器（Gilson，型号：P1000，目录号：F123602）
Gilson PIPETMAN经典移液器（Gilson，型号：P20，目录号：F123600）
Gilson PIPETMAN经典移液器（Gilson，型号：P200，目录号：F123601）
Gilson PIPETMAN经典移液器（Gilson，型号：P2，目录号：F144801）
水浴（Fisher Scientific，型号：FS-14）
Vortexer（Fisher Scientific，目录号：02-216-108）
ABI Prism 7900HT序列检测系统（PE-Applied Biosystems）（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：ABI PRISM TM> 7900HT）

程序

NP-40分馏
1. 每孔用2ml PBS洗涤2次。平板应该在90-95％汇合处具有5-10×10 6个细胞。
2. 胰蛋白酶消化细胞（500μl/孔）并加入1ml /孔的培养基中和。结合每个板的6个孔。可以使用单一的10厘米盘，同样的90-95％的汇合点与3-6×10 7个细胞。
3. 在4℃，100×g下旋转细胞5分钟。
4. 用1ml PBS重悬细胞。
5. 颗粒细胞在100℃下在4℃下4分钟。
6. 将细胞重悬于200μlTMK。
  注意：对于全细胞提取的qPCR分析，您可以在进行步骤B之前取出50μl并提取DNA。
7. 加入150μlTMK + 1％NP-40。
8. 在冰上孵育5分钟，偶尔轻轻摇动。
9. 颗粒在228℃下在4℃下5分钟。
10. 去除上清液而不干扰沉淀物 - 这是细胞质级分。
11. 将剥离的核丸悬浮在500ml S1缓冲液中
12. 将S1悬浮颗粒层叠在500ml S2缓冲液上
13. 在4℃下以1,430×g离心5分钟。
14. 吸出上清液。
15. 将细胞核重悬于300μlPBS中。
  注意：此时，所有样品可以在4°C保存过夜，然后再继续步骤B.
DNA提取
1. 向细胞提取物中加入600μl冰冷的细胞裂解缓冲液。大部分提取物需要SDS降解;它不会影响最终的结果。彻底旋转30秒。
2. 加入3μl蛋白酶K溶液（20 mg / ml）。在55℃孵育DNA样品3-16小时。时间取决于使用的样品和细胞系上注意到多少SDS沉淀。经验法则是更多的SDS沉淀和较大的细胞倾向于需要更多的孵育时间。
3. 剪切DNA通过21 G针反复拉伸（15 x），避免过度起泡和气雾化损失。
4. 将其冷却至室温，然后加入3μl4mg / ml无DNA酶的核糖核酸酶A.消化物在37℃下15-60分钟。
  注意：此时，所有样品可以在4℃下储存过夜，然后再进行到步骤B5。
5. 酷到RT。加入200μl5 M醋酸钾;涡旋20秒
6. 颗粒沉淀蛋白/ SDS通过在4℃下以最大RPM离心3分钟。
7. 将溶液用600μl异丙醇转移到新鲜管中。通过倒置混合在最高转速下旋转3分钟。
8. 去除上清液，用600μl70％乙醇洗涤DNA。以最大RPM旋转3分钟以沉淀颗粒。吸出乙醇。重复1分钟旋转并吸出剩余的EtOH。
9. 空气干燥15分钟。
10. 将沉淀重新溶解在100μl8mM NaOH或10mM Tris中。这可能很慢 - 建议在37℃孵育15分钟。
11. DNA现在可以在-20°C储存，无事故。
评估NP-40分馏效率
为了评估核 - 细胞质分离的准确性，可以使用qPCR，使用核，线粒体和全细胞提取物样品，如下列实施例。
1. 将DNA样品在dH 2 O 2中稀释1至10，并在98℃下孵育20分钟，然后在冰上立即冷却。
2. 每个PCR反应在15μl反应体积中含有7.5μlSYBR Green PCR Master混合物（Fermentas），2μl模板和1μM每种引物（表1）。
  
  表1. DNA扩增引物
3. 使用ABI Prism 7900HT序列检测系统（PE-Applied Biosystems）对每个样品进行一式三份的QPCR进行扩增和检测。 PCR条件如下：

数据分析

NP-40核 - 细胞质部分的准确性可以通过比较核部分中检测到的线粒体DNA拷贝的量和细胞质部分中β-珠蛋白DNA拷贝的量与在总细胞裂解物中发现的各个拷贝的量来验证。数据通过delta方法进行分析，需要平均阈值周期和标准偏差。因此，
Ct =阈值循环，a =核或细胞质样品，b =全细胞裂解物样品：
将回收的产量与核级分中的细胞质污染相比较。图1改编自Galvis（2014）是可以用获得的数据组成的数据分析图的示例。线粒体DNA拷贝在核心部分与线粒体DNA拷贝在全细胞裂解物中的比例。该示例演示了成功的分馏。核部分核DNA与全细胞提取物的比例为1：1;而与整个细胞提取物相比，同时存在最小的线粒体DNA。与整个细胞提取物相比，细胞质级分含有最小的核DNA，而其中含有线粒体DNA与全细胞提取物的几乎1:1的比例。
请注意，推荐的包含数据是所有三倍体必须在彼此相隔一个周期内，所有获得的循环必须小于需要包含在qPCR运行中的阴性对照。

图1.分馏方案的样品数据分析这是核和细胞质级分中的线粒体和β-珠蛋白DNA与总细胞裂解物的比例。用DBR1 shRNA pHyper-D4（D4）或DBR1 shRNA三重不匹配，pHyper-M4（M4）转染GHOST-R5X4细胞。二至二十四小时后，将细胞分成细胞核和细胞质级分，或裂解制备全细胞提取物。分离DNA用于qPCR以评估分级的成功。 A.与全细胞提取物相比，β-球蛋白引物用于测定细胞质级分中的核污染排除。该图示出了在整个细胞裂解物中细胞质级分中的β-珠蛋白拷贝与β-珠蛋白拷贝的比例。 B.与全细胞提取物相比，β-球蛋白引物用于测定核分数的浓度。该图示出了在全部细胞裂解物中核分数中β-珠蛋白拷贝与β-珠蛋白拷贝的比例。 C.线粒体引物用于测定细胞质分数与全细胞提取物相比的浓度。该图示出了在全部细胞裂解物中核分数中的线粒体DNA拷贝与β-珠蛋白拷贝的比例。 D.线粒体引物用于检测核提取物中线粒体污染的排除

笔记

方法C中提供的数据是Galvis等人于2014年提出的实验的未发表的对照。我们实验中的脱支酶1（DBR1）涉及HIV-1基因组的逆转录。
在步骤A中，步骤12，不要干扰沉淀物是非常重要的，因此最好留下一些上清液。后续步骤的目的是去除剩余的线粒体DNA。
在我们的经验中，与10mM Tris相比，用8mM NaOH重新悬浮DNA给下游应用提供更好的总体回收率。然而，如果所需的实验仅需要qPCR目的，而不需要测序，则10mM Tris足以使最终沉淀物再悬浮。

食谱

1M MgCl 2（500ml）
将101.65g MgCl 2•6H 2 O加入到500ml ddH 2 O中，在室温下存放
2.5 M蔗糖
8.55克蔗糖高达10毫升与ddH 2 O
需要加热至37°C以使蔗糖完全溶解在室温下存放
TMK（10 ml;储存于4°C）
TMK + 1％NP-40（2 ml）
1.8 ml TMK
200μl10％NP-40
储存于4°C
S1缓冲区
0.25 M蔗糖 10mM MgCl 2
S2缓冲区
0.35 M蔗糖
0.5mM MgCl 2
储存于4°C
细胞裂解缓冲液
10mM Tris-HCl，pH 7.4
0.1％SDS
1 mM EDTA
储存于4°C

致谢

这项工作部分得到加州艾滋病毒/艾滋病研究计划的ID07-I-124授予David Camerini的支持。支持UCI病毒研究中心，UCI癌症研究所和ao族综合癌症中心。 Alvaro Galvis由UCI医学科学家培训计划支持，授予T32-GM08620。这个协议是从原来的Sambrook和Russell，2001修改和修改的。

参考

Galvis，A.E。（2014）。 HIV-1 cDNA合成中的RNA系列中间体。 ProQuest 3615193。
Galvis，A.E.，Fisher，H.E.，Nitta，T.，Fan，H.and Camerini，D。（2014）。由DBR1敲低造成的HIV-1 cDNA合成的损害。 Vi Vi < 88（12）：7054-7069。
Sambrook，J.and Russell，D.W。（2001）。分子克隆：实验手册。CSHL Press 。