材料和试剂

粘合显微镜载玻片（CITOTEST LABWARE MANUFACTURING，目录号：80312-3161-16）

注意：这些幻灯片具有特殊的处理过程，将组织静电粘附到玻璃上，而不需要粘合剂或蛋白质涂层。

封面（CITOTEST LABWARE MANUFACTURING，目录号：80342-1130）

细胞培养皿（100×10mm）（Corning，目录号：430167）

动物：4个月大的Sprague Dawley（SD）大鼠

水合氯醛（国药化学试剂，目录号：30037517）

氯化钠（NaCl）（广东光华科技，目录号：1.01307.040）

多聚甲醛（PFA）（广东光华科技，目录号：1.17767.014）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Beyotime Biotechnology，目录号：C0221A）

Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：V900502）

明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G7041）

抗S100蛋白抗体，小鼠中产生的克隆15E2E2（S100）（Merck，目录号：MAB079-1）

抗兔神经丝200抗体（NF）（Sigma-Aldrich，目录号：N4142）

Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-11001）

Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-11011）

TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）

4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）

荧光固定介质（Vector Laboratories，目录号：H-1000）

10％水合氯醛（见配方）

0.9％NaCl（参见食谱）

4％PFA（见配方）

0.1％Triton X-100（参见食谱）

阻塞缓冲区（见配方）

PBST（见配方）

1,000x DAPI（见配方）

设备

解剖剪刀和镊子（见图1A）

灌注泵（较长，目录号：BT300-1F）

春季剪刀（66 Vision Tech，目录号：54053B）（见图2A）

精镊子（Fine Science Tools，Dumont，型号：＃5SF，目录号：11252-00，参见图2A）

黑色湿室（Leibusi，目录号：340012）

注意：湿室（Leibusi，目录号：340012）由当地的车间制作。

立体显微镜（Olympus，目录号：SZ61）

程序

麻醉大鼠腹膜内注射10％的水合氯醛（0.3ml / 100g）（参见食谱）。

注意：动物使用由南方医科大学动物护理和使用委员会批准，实验程序按照动物伦理治疗指南进行。所有努力都是为了尽量减少动物的牺牲和痛苦。

用大剪刀和镊子，通过切开胸腔打开心脏。

使用灌注泵，用冷的0.9％NaCl灌注大鼠（参见食谱），通过心脏灌注清除体内的血液。

用冷的4％PFA（见食谱）灌注大鼠，以固定大鼠，直到它变硬。

用大剪刀和镊子切割皮肤以暴露股二头肌和肌间隔（见图1B）。

用小剪刀和镊子将股二头肌沿着肌间隔分开，以露出坐骨神经（见图1C）。

图1.暴露坐骨神经。 A.用于解剖坐骨神经的剪刀和镊子; B.除去皮肤后，显示股二头肌（BF）和肌间隔（IS）。 C.解剖股二头肌后，观察到坐骨神经。 C'。 C的放大图像显示坐骨神经，然后将其从大鼠中取出

使用小剪刀剪下膝盖和坐骨神经缺口处的神经，获得神经，并在4℃保存4％PFA过夜，进行固定。

使用弹簧剪将固定神经切断为3-5毫米的神经节，并将其放置在室温（RT）下的PBS填充盘中（见图2B）。

使用细镊子去除在立体显微镜下包裹神经的神经节（参见图2C）。

注意：神经节是围绕神经的致密不规则结缔组织的最外层。在固定后，它看起来比神经纤维更透明

将无神经节神经转移到浸在PBS中的粘附片上（见图2D）。

使用细镊子将神经取出立体显微镜下的部分，并仔细分离单根纤维（见图2E）。

注意：当将神经分成几部分时，一些纤维将单独或以小组从神经束分离。然后将解离的纤维与纤丝分离，并仔细挑选成单根纤维，而不会破坏它们。漂浮在PBS中的孤立纤维显示为白色，半透明

使用细镊子仔细地将单个单个神经纤维刷到粘附显微镜载玻片上（见图2F）。

注意：在此步骤中纤维对载玻片的良好粘合是必不可少的，并且确保纤维良好地粘附在载玻片上。连接到幻灯片上的整个光纤没有任何分离，表明良好的遵守。

图2.分开单个纤维的分步程序。 A.弹簧剪刀和钳子用于挑逗神经; B.去除神经节之前的神经节;神经上颌神经（箭头）从神经和无神经神经筋膜（箭头）半剥离。 D.在立体显微镜下将沉浸在PBS中的神经筋膜放在盘中的粘附载玻片上; E.单个纤维的神经纤维; F.直接单个单个神经纤维粘附在幻灯片上。

将玻片从PBS中取出，用吸收纸吸收载玻片上残留的液体。

空气干燥附着的纤维，并在4℃下保存过夜，以增强粘附力。

在随后的几天内尽快免疫染色细纤维（步骤16-26）以进一步分析。

注意：将幻灯片放在-80°C进行长期存储。然而，在第二天进行的免疫荧光染色通常得到最有保证的结果。

用PBS洗涤载玻片上的纤维3次（每次10分钟）

将含有0.1％Triton X-100（参见食谱）的纤维在PBS中孵育30分钟以穿透膜。

使用封闭缓冲液（见食谱）孵育纤维1小时。

在4℃下将纤维与一抗孵育过夜。

注意：在本方案中，抗S100（1:400，在封闭缓冲液中稀释）以显示施旺细胞细胞质的主要抗体和抗NF（1:800，在封闭缓冲液中稀释）以显示神经元轴突。

用PBST洗涤纤维3次（每次10分钟）（参见食谱）。

在室温下将纤维与二抗孵育2小时。

注意：在PBST中以1:400的稀释度使用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H + L）和AlexaFluor®568山羊抗兔IgG（H + L）的二抗。

用PBST洗涤纤维3次（每次10分钟）。

在PBS中用DAPI（见食谱）培养1μg/ ml纤维5分钟

用PBST洗涤纤维5分钟

用安装介质和盖玻片安装光纤。

用荧光显微镜拍摄图像。

数据分析

代表性的免疫荧光染色图像显示了图3中妊娠神经纤维的结构

图3.代表性的免疫荧光染色图像显示了妊娠神经纤维的结构。 A.将来自2周龄大鼠坐骨神经的单个单独的神经纤维用S100（特异性标记物）双重染色在Schwan细胞的细胞质中表达）和神经丝（NF，用于显示轴突的特异性标记）。 B.用S100细胞免疫染色4个月大鼠坐骨神经纤维的单个神经纤维，以显示仅存在于成年神经纤维中的Cajal带（CB）和Schmidt-Lanterman切口（SLI）的详细结构。 PNC，核周细胞质; NR，Ranvier的节点。

注意：两个图像都用DAPI染色，以显示施万细胞的核。＆nbsp;

食谱

10％水合氯醛

将10克水合氯醛溶解于100ml蒸馏水中，保存在4℃，防止光照，并在制备后1周内使用

0.9％NaCl

将9克NaCl溶于1000毫升蒸馏水中，储存于4℃，准备后1周内使用

4％PFA

在1,000 ml PBS中稀释40 g PFA
在65°C下搅拌直到完全溶解，储存在4°C，并在准备后2个月内使用

0.1％Triton X-100

将100μlTriton X-100稀释到100ml PBS中，在室温下储存，并在制备后6个月内使用

PBST

将500μlTWEEN ® 20稀释到1,000ml PBS中至含有0.5％TWEEN 20的溶液中，在室温下储存，并在制备后2个月内使用

阻塞缓冲区

将0.5 g明胶（5％，w / v）溶于10ml PBS中，加入300μlTriton X-100（0.3％）至缓冲液中，储存于-20°C，准备后6个月内使用。

1,000x4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）

将5mg DAPI溶解在5ml蒸馏水中，制备1mg / ml的1,000x储备溶液，储存于-20℃，制备后2年内使用，并在使用PBS前用PBS稀释至1x。

致谢

该协议是从以前发表的文章（Wen等人，2017年）中改编的。这项工作得到了国家重点基础研究计划（2014CB542202和2014CB542205），国家自然科学基金（30973095,81371354＆amp; 81571182）的支持。广州科技项目（12C32121609）和广东省自然科学基金（S2013010014697）至郭国。

参考

Wen，J.，Qian，C.，Pan，M.，Wang，X.，Li，Y.，Lu，Y.，Zhou，Z.，Yan，Q.，Li，L.，Liu，Z.， Wu，W.and Guo，J.（2017）。靶向RhoA的慢病毒介导的RNA干扰减轻了施旺细胞的迁移，增殖和髓鞘形成。 Mol Neurobiol 54（2）：1229-1239。