材料和试剂

盖玻片（VWR，目录号：89015-725）
BD Falcon15ml离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352096）
BD Falcon 35 mm细胞培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：353001）
24孔板（Corning，Falcon ®，目录号：353226）
玻璃滑梯（HiMedia Laboratories，目录号：CG029）
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
siRNA（Dharmacon）
Xtremegene HD转染试剂（Roche）
DMEM（Lonza，目录号：12-604F）
NEAA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11140050）
GlutaMax（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：35050061）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15630080）
DQ-Red BSA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D12051）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D1306）
HI FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10082147）
1x DPBS（Lonza，目录号：17-512F）
16％多聚甲醛（PFA）（电子显微镜科学，目录号：15700）
Fluoromount G（Southern Biotech，目录号：0100-01）
DQ-Red BSA的储备溶液（参见食谱）
DAPI库存解决方案（见配方）

设备

CO 2培养箱（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Galaxy 170R）
共焦显微镜（ZEISS，型号：LSM 710）

软件

ImageJ软件（NIH）

程序

HeLa细胞中的贩运DQ-红色BSA
注意：本协议提供了使用DQ-Red BSA作为HeLa细胞中的货物进行贩运测定的一般准则和程序。对于其他细胞类型，检查哪些培养基和培养基补充您正在使用的细胞系，然后开始培养。提供的细胞数量，使用的DQ-BSA的浓度和转染条件作为起点。我们建议用户根据用于测定的细胞类型优化这些条件，以获得最佳效果
1. 根据要进行的实验，将细胞接种在盖玻片上，例如siRNA转染或用于过表达研究的质粒转染。
  注意：对于RNAi研究，在含有4个玻璃盖玻片的35mm细胞培养皿中种植60,000个HeLa细胞。 16小时后，将单独的玻璃盖玻片转移到24孔细胞培养板上，如下一步所述进行siRNA处理。对于过表达相关实验，在含有4个玻璃盖玻片的35mm细胞培养皿中培养0.18Mg HeLa细胞，并在细胞接种16小时后进行转染，如下所述进行。推荐用户根据细胞类型及其生长速度优化细胞接种密度。一般来说，对于高达48-72小时的RNAi研究，起始细胞密度应保持在15-20％左右。对于过表达研究，转染当天细胞的汇合度应为约40％。
2. 在细胞中进行外源质粒的基因沉默或过表达。使用Dharmafect（GE）试剂根据制造商的方案转染siRNA，并使用XtremegeneHD（Roche）进行质粒DNA转染。
3. 一旦siRNA处理实现了有效的基因沉默，则进行测定，或者在过表达研究的情况下转染质粒时观察到外源基因的表达。
  注意：对于使用Dharmafect（GE）试剂的RNAi研究，在siRNA转染HeLa细胞后48小时内可以实现内源性基因的80％沉默。类似地，在HeLa细胞中使用Xtremegene HD转染试剂（Roche）可以在转染后16小时内实现外源质粒的表达。然而，建议用户确定最佳条件（siRNA浓度，siRNA处理时间，转染试剂，质粒浓度等），以实现其所选择的细胞系的感兴趣基因或转染基因表达的有效沉默。一旦优化了这些参数，请继续进行转染后的检测。
4. 准备媒体贩运BD Falcon 15 ml离心管，如下所示：
  贩运媒介：DMEM + 1％血清+ 1％NEAA + 1％GlutaMax + 1％HEPES
  注意：一个24孔板的一个孔300μl就足以淹没细胞。增加所需介质的数量，根据菜的大小。
5. 在37°C温暖媒体。
6. DQ-BSA制备：储备浓度-2mg / ml;工作浓度为10μg/ ml
7. 计算所需的DQ-Red BSA的量，并添加到在37°C预热的贩卖媒体。将此混合物在37°C再保持5分钟。
  注意：始终确保在制作配体运输介质混合物即DQ-Red BSA与贩运介质混合之前旋转库存DQ-Red BSA（参见食谱）管。此将确保可能干扰贩运测定和结果分析的任何DQ-BSA聚集体。
8. 用预热的1x DPBS将接种在盖玻片上的细胞洗涤一次。
9. 将配体运输培养基混合物添加到细胞中，并在37℃下在5％CO 2加湿细胞培养室中孵育1小时和6小时。
10. 在所需的时间点后，在室温下将在1x DPBS中制备的4％PFA的细胞固定10分钟
11. 为了标记细胞核，可以进行DAPI染色。在无菌水中制备1mg / ml的DAPI储备溶液，并用1：1,000稀释液染色细胞。用含有DAPI的溶液孵育盖玻片20分钟，然后用1x DPBS洗涤3次，并使用Fluoromount G将玻片盖上玻片。
12. 有关更多信息，请鼓励读者查看视频1.
  
  Video 1. Demonstration of how to perform DQ-Red BSA trafficking assay. The video describes the steps of DQ-Red BSA trafficking assay including preparation of cargo containing media, important precautions to be taken and the method of performing the experiment.
成像，量化和数据分析
1. 使用共聚焦显微镜（LSM 710，ZEISS）在单个平面上成像细胞。
2. 使用ImageJ软件（NIH）分析图像。
3. 量化校正的总细胞荧光（CTCF），如下所述：
  1. 在ImageJ软件中打开所需的共焦图像（.lsm文件格式）。
  2. 拆分通道并保持所需通道的窗口打开。
  3. 使用"手写选择"工具制作轮廓来选择单元格。
  4. 转到"分析"→"设置测量"→"选择区域，集成密度和平均灰度值"
  5. 再次转到"分析"→点击"测量"。
  6. 打开结果窗口，将值复制到Excel工作表。
  7. 为了测量图像的背景强度，请选择图像中没有单元格的5个随机区域，并重复上述步骤。
  8. CTCF =平均综合强度 - （平均面积×平均背景平均值）
  9. 计算每个单元格的CTCF并绘制平均值。有关更多信息，请鼓励读者查看图4.
    
    图4.使用ImageJ的CTCF分析的重要步骤截图
4. 为了分析单元格中的DQ-Red BSA点数，使用ImageJ软件的"Analyze Particle"工具进行如下定量：
  1. 在ImageJ软件中打开所需的共焦图像。
  2. 拆分图像的通道，并选择您感兴趣的频道。关闭其余频道。
  3. 如果图像中有多个单元格，则将所选通道中感兴趣的单元格裁出。
  4. 复制图像（快捷键Ctrl + Shift + D）。
  5. 选择两个重复图像中的任何一个，并按照以下步骤执行。
  6. 转到"图像"→"调整"→"阈值"→从下拉框中选择算法，看看哪一个突出显示图像中的点状结构，或手动设置阈值→"应用"。
  7. 转到"分析"→"设置测量"→选择"平均灰度值，面积和限制到阈值"
  8. 在同一窗口中，重定向至选择第4步中选择的图像→按"确定"。
  9. 转到"分析"→"分析粒子"→选择"显示结果并进行总结"→按"确定"。
  10. 将打开两个结果窗口。人们将具有来自每个粒子的数据，而另一个将是具有所分析的细胞中所有粒子的平均值的总结。将数据复制到Excel表并分析。
  11. 结果汇总文件显示分析的颗粒总数，这是一个单元格中DQ-Red BSA点的数量。有关更多信息，请鼓励读者查看图5.
    
    图5.使用ImageJ进行粒子计数分析的重要步骤的截图

数据分析

为了计算"校正总细胞荧光（CTCF）"并分析"DQ-Red BSA punctae"的数量，鼓励读者分别参见图4和图5。有关更多信息，请参见"Marwaha，R.，Arya，S.B.Jagga，D.，Kaur，H.，Tuli，A.和Sharma，M。（2017）。 Rab7效应物PLEKHM1结合Arl8b以促进对溶酶体的货运。 J Cell Biol 216（4）：1051-1070'。

食谱

DQ-Red BSA的储备溶液
1. DQ-Red BSA作为1mg冻干粉末提供
2. 制备2mg / ml DQ-Red BSA的原液，溶于500μl1x DPBS中
3. 通过旋涡和移液彻底混合
4. 重建后在4°C储存
5. 用铝箔覆盖小瓶避免光照
DAPI库存解决方案
1毫克/毫升无菌水
注意：使用1：1,000稀释液的染色溶液染色细胞

致谢

该方案已经从先前发表的研究（Pols等人，2013）进行了修改和修改。作者要感谢Imran Sayeed（在伊斯坦布尔莫哈利举行的第三年的BS-MS学生）为准备录像带做出了贡献。 R. Marwaha承认印度科学教育与研究所Mohali（IISER Mohali）的财政支持。谢尔玛（Sharma）承认了惠康信托基金/生物科技部（DBT）的财务支持。这项工作得到了授予M.Sharma（IA / I / 12/1/500523）的维康信托基金/ DBT印度联盟中级奖学金的支持。夏尔马还承认了伊斯兰堡的Mohali的基础设施和财政支持。作者宣称没有竞争的经济利益。

参考

Garg，S.，Sharma，M.，Ung，C.，Tuli，A.，Barral，D.C.，Hava，D.L.，Veerapen，N.，Besra，G.S.，Hacohen，N。和Brenner，M.B。（2011）。溶酶体贩运，抗原呈递和微生物杀伤由Arf样GTPase Arl8b控制。 a> 免疫 35（2）：182-193。
Jovic，M.，Sharma，M.，Rahajeng，J.and Caplan，S。（2010）。早期内体：在十字路口的蛋白质繁忙的分拣站。 Histol Histopathol 25（1）：99-112。
Khatter，D.，Raina，V. B.，Dwivedi，D.，Sindhwani，A.，Bahl，S。和Sharma，M。（2015b）。小型GTPase Arl8b调节哺乳动物HOPS复合物在溶酶体上的组装。 J Cell Sci 128（9）：1746-1761。
Khatter，D.，Sindhwani，A.和Sharma，M.（2015a）。类似Arf的GTPase Arl8：从外围移动到溶酶体生物学的中心。 Cell Logist 5（3）：e1086501。
Marwaha，R.，Arya，S.B.，Jagga，D.，Kaur，H.，Tuli，A.和Sharma，M。（2017）。 Rab7效应器PLEKHM1结合Arl8b以促进货运流向溶酶体。 Cell Biol 216（4）：1051-1070。
Maxfield F. R.和Yamashiro D.J. （1987年）。内质子酸化和受体介导的内吞作用的途径。 Adv Exp Med Biol 225：189-98。
Pols，M. S.，ten Brink，C.，Gosavi，P.，Oorschot，V.and Klumperman，J。（2013）。 HOPS蛋白hVps41和hVps39是同型和异型晚期内体融合所必需的。 Traffic 14（2）：219-232。