材料和试剂

移液头（2μl，200μl，1,000μl）
1.5 ml微量离心管
离心过滤器，改良PES，10K（VWR，目录号：82031-348）
200μlPCR管
成熟的拟南芥叶子（2或3叶）
液氮
乙醇（Merck，目录号：1.00983）
II型净化水
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：179973）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
木霉木霉纤维素酶悬浮液（Megazyme，目录号：E-CELTR）
吡啶（VWR，目录号：27199.292）
硫柳汞（Sigma-Aldrich，目录号：T5125）
氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：106469）
乙酸（AppliChem，目录号：141008.1611）
2,5-二羟基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：39319）
2-羟基-5-甲氧基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：146188）
乙腈（Merck，目录号：1.00029）
葡聚糖寡糖混合物（Megazyme，目录号：O-XGHON）
消化缓冲液（参见食谱）
超级DHB（SDHB）矩阵（见配方）

设备

可变体积单通道手动移液器（0.2至2μl，2至20μl，10至100μl，100至1,000μl）
颗粒杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z359947）
台架钻，250瓦
绝缘泡沫块
聚碳酸酯盖
干块加热器
Vortexer
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
SpeedVac系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Savant TM SC210 P1）
超声波浴
轨道摇床
MALDI靶板（Bruker，型号：MTP 384 Ground steel TF，目录号：8209519）
质谱仪（Bruker，型号：UltraFlex III MALDI-TOF / TOF）

软件

Flex Analysis 3.0版（Bruker）

程序

细胞壁提取
1. 在微量离心管中收集100毫克成熟的拟南芥叶（2或3叶）。
  注意：我们通常在22°C / 18°C光/黑暗温度下，在16小时内从4至5周龄的植物中收集完全扩张的叶子，没有衰老迹象。
2. 用约600转/分钟的台式钻头上的研杵研磨数秒钟，保持样品浸没在液体N 2（见图1）。不要向样品中加入液氮N 2。应在样品之间更换杵。
  
  图1.研磨设置将塑料60毫升容器的下半部分插入绝缘泡沫块中，并覆盖有多孔聚碳酸酯。加入通道以便于添加液体N 2。
3. 加入1毫升80％乙醇。旋转5秒，并在50℃下在干燥块加热器中加热10分钟。以3,000×g离心5分钟，弃去上清液
4. 向沉淀物中加入1ml 100％乙醇。涡旋5秒，并在室温下保持10分钟。以3,000×g离心5分钟，弃去上清液
5. 向沉淀物中加入1毫升丙酮。涡旋5秒，并在室温下保持10分钟。以3,000×g离心5分钟，弃去上清液
6. 干燥样品在Speed-Vac中大约5分钟。
  注意：我们尽量避免完全干燥以促进再悬浮。样品也可以风干。干燥样品可以储存在-20°C进行后续处理。
提取可酶切的木葡聚糖
1. 向干燥的壁残留物中加入1ml 100mM NaCl，并重悬于超声浴中至少20分钟。在再悬浮过程中将样品涡旋5秒钟。以18,000×g离心3分钟，弃去上清液。
2. 向细胞壁残渣中加入1ml水，旋转5秒，并在超声波浴中孵育至少5分钟。以18,000×g离心3分钟，弃去上清液。重复两次。
3. 加入350μl消化缓冲液（参见食谱）。
  注意：完全重新悬浮是不必要的，因为它将在夜间孵化完成。
4. 移取一定量的纤维素酶悬浮液，每个样品含有6单位酶到离心过滤器中。体积将根据酶批次而变化。加入450μl消化缓冲液。离心5分钟，放置14,000 x g，然后弃去滤液。
5. 加入450μl消化缓冲液。以14,000xg离心5分钟并弃去滤液。重复两次。
6. 将50μl每个样品的消化缓冲液加入到渗余物中并移液至干净的离心管注意：步骤B4至B6可以在细胞壁残留物重悬时进行。
7. 将50μl步骤B6中得到的酶溶液移至步骤B3的每个重悬细胞壁样品。
8. 在37°C和150 rpm的轨道振荡器中孵育过夜
9. 第二天，通过加入500μl水洗涤每个样品的一个离心过滤器，以14,000xg离心3分钟并除去滤液。重复此过程总共3次。
  注意：此步骤是去除痕量的聚合物，否则会影响MALDI-TOF分析。
10. 以18,000 x g离心细胞壁消化5分钟。
11. 将上清液移至预先冲洗的离心过滤器。以14,000 x g离心10分钟。
12. 丢弃过滤器并在Speed-Vac上干燥滤液。
  注意：有些残留物通常在管底部可见。
13. 储存于-20°C。
提取不可接触的木葡聚糖
1. 通过加入1ml水，从可接近的木葡聚糖提取物（步骤B10的沉淀）洗涤细胞壁残留物，以18,000×g离心5分钟并弃去上清液。重复两次。
2. 加入900μl17％NaOH（w / v），并在37°C的轨道振荡器中孵育过夜。
3. 加入300μl乙酸，并以18,000 x g离心5 min
4. 将500μl上清液吸取到离心过滤器上，以14,000 x g离心10-15分钟，弃去滤液。添加额外的上清液并重复，直到所有的上清液都被过滤
5. 向滤器中加入500μl消化缓冲液，以14,000 x g离心15-20分钟，弃去滤液。重复两次。
6. 将350μl消化缓冲液加入过滤器，并将渗余液移至新的微量离心管
7. 按照步骤B4中提取可酶切的木葡聚糖的步骤。
MALDI-TOF分析
1. 通过重复移取将干燥的木葡聚糖消化（步骤B13）重悬于20μl10mM NaCl中。以18,000 x g离心2分钟。
2. 将2μl从溶液顶部吸取到干净的200μlPCR管中，加入6μlSDHB溶液（参见食谱）。移取2μl混合物到MALDI靶板上。
3. 准备2μl2mM木葡聚糖寡糖（Megazyme）溶液与6μlSDHB溶液的校准点混合物。将2μl混合物吸入MALDI靶板上
4. 在室温下空气干燥大约30分钟注意：解剖显微镜可用于检查样品。板上应有一些晶体（图2）。
  
  图2. MALDI板上结晶的实例。尽管左侧的样品更清洁，但两者均可生成可用的光谱。酒吧= 1毫米。
5. 将目标板装载到MALDI-TOF / TOF质谱仪上。
6. 以10ns的PIE（脉冲离子提取）在25kV的加速电压下以反射和正模式操作质谱仪。在450 Da处设置矩阵抑制。平均共有600张激光照片，以3套200张（100 Hz）传送到3个不同的地点。
7. 使用校准点校准质量范围。三个主峰对应于以下钠加合物：XXXG（C39 66 33 1 1， 1085.3384Da），XXLG / XLXG（C H 38 1 1,127.3912）和XLLG C H 86 1 1 1> 1，1409.4440）。这些缩写对应于标准的木葡聚寡糖命名法（Tuomivaara et al。，2015）。
8. 使用Flex Analysis 3.0版（通过绘制所有检测到的离子物质的电荷质量与其测量的强度（y轴））的质量（x轴），绘制每个样品的质谱图（布鲁克）

数据分析

使用具有信号噪声阈值设置为3的SNAP（复杂数值注释步骤）的Flex Analysis标签峰。程序将从每个m / z的同位素包络计算峰的面积（图3 ）。将数据导出到Excel。

图3. Flex Analysis的屏幕截图显示了具有其区域的已识别峰的列表，以及1597
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手动选择对应于木葡聚糖片段的m / z 的峰。存在于野生型木葡聚糖中的那些显示在表1中。总和峰的总面积并计算对应于每个鉴定的木葡聚糖片段的总面积的比例。平均至少三次独立提取。可以使用Student's t检验或其他统计方法来比较不同基因型中木葡聚糖片段的比例。不可接近的木葡聚糖的提取导致乙酰基的损失，并且仅观察到非乙酰化的片段。与不可接触的木葡聚糖相比，在可及的木葡聚糖中更明显的变化可能是由于木葡聚糖在墙壁中的代谢引起的。

表1.野生型哥伦比亚叶中存在的木葡聚糖片段的结构和m / z 值。结构缩写对应于标准的木葡聚糖寡糖命名法，乙酰化由下划线的符号表示（Tuomivaara等人，2015）。加合物组成指示为己糖（H），脱氧己糖（DH），戊糖（P），乙酰基（Ac）和钠原子（Na）的数目。其他寡糖加合物的m / z值可以使用下式计算：162×H + 146×DH + 132×P + 42×Ac + 41.

笔记

可以向SDHB溶液中添加诸如麦芽低聚糖或低聚糖的内标，用于绝对定量。提取前用水冲洗少量木葡聚糖（Günl和Pauly，2011）。本协议中使用的内切葡聚糖酶似乎在每个单一未取代的葡萄糖前面切割。当分析不寻常的木葡聚糖时，具有不同特异性的其他内切葡聚糖酶可以产生不同的片段（Günlet al。，2011）。该方法不能分离相同质量的片段，例如XLXG和XXLG，尽管在某些情况下，可以将MALDI-TOF / TOF用于相同的样品以鉴定片段（Sampedro等人，2010; Sampedro等人，2012; Sampedro等人，2017）。

食谱

消化缓冲液
36.6μl乙酸
29μl吡啶
20毫克硫柳汞
100ml水
储存于4°C
SDHB矩阵
9mg ml 2,5-二羟基苯甲酸
1mg ml 2-羟基-5-甲氧基苯甲酸 70％乙腈 30％水
在-20°C储存一个月

致谢

这个协议在Sampedro等人（2017）中简要描述。这项工作得到经济部长（授权号BIO2012-40032-C03-01）和Xunta de Galicia（授权号PGIDIT10PXIB200305PR）的支持。

参考

Günl，M.，Gille，S.和Pauly，M。（2010）。细胞外多糖的OLIgo质谱分析（OLIMP）。 Vis Vis < / em>（40）。
Günl，M.，Neumetzler，L.，Kraemer，F.，de Souza，A.，Schultink，A.，Pena，M.，York，W.S。和Pauly，M。（2011）。 AXY8编码α-岩藻糖苷酶，强调了重组代谢对细胞结构的重要性拟南芥细胞壁多糖。植物细胞23（11）：4025-4040。
Günl，M。和Pauly，M。（2011）。 AXY3 编码影响结构和可达性的α-木糖苷酶拟南芥植物细胞壁中的半纤维素木葡聚糖。植物233（4）：707-719。
Lerouxel，O.，Choo，T.S.，Seveno，M.，Usadel，B.，Faye，L.，Lerouge，P。和Pauly，M。（2002）。通过酶促低聚糖指纹图谱对植物细胞壁突变体的快速结构表型。 Physiol 130（4）：1754-1763。
Park，Y.B。和Cosgrove，D.J。（2015）。木葡聚糖及其与日益增长的细胞壁的其他成分的相互作用。 Cell Physiol 56（2）：180-194。
Pauly，M.，Albersheim，P.，Darvill，A.and York，W.S。（1999）。高等植物细胞壁中纤维素/木葡聚糖网络的分子结构域。植物J 20（6）：629-639。
Sampedro，J.，Gianzo，C.，Iglesias，N.，Guitian，E.，Revilla，G。和Zarra，I。（2012）。 AtBGAL10是拟南芥中主要的木葡聚糖β-半乳糖苷酶，其缺失导致不寻常的木葡聚糖亚基和生长缺陷。植物生理学158（3）：1146-1157。
Sampedro，J.，Pardo，B.，Gianzo，C.，Guitian，E.，Revilla，G。和Zarra，I.（2010）。拟南芥中缺乏α-木糖苷酶活性改变木葡聚糖组成并产生生长缺陷。植物生理学154（3）：1105-1115。
Sampedro，J.，Valdivia，E.R.，Fraga，P.，Iglesias，N.，Revilla，G。和Zarra，I.（2017）。可溶性和膜结合的β-葡糖苷酶参与修剪木葡聚糖骨架。植物生理学173（2）：1017-1030。
Tuomivaara，S.T.，Yaoi，K.，O'Neill，M.A.and York，W.S。（2015）。不同木葡聚糖衍生的寡糖的文库的生成和结构验证，包括木葡聚糖命名法的更新。
Carbohydr Res 402：56-66。