材料和试剂

2 ml离心管
方格培养皿（Greiner Bio One International，目录号：688161）
石蜡膜（Bemis，目录号：PM992）
50ml Falcon tube
Scalpel刀片（NO。10A，Swan Morton，目录号：0302）
无菌滤纸（GE Healthcare，目录号：1004-090）
培养皿92 x 16毫米w / o凸轮（SARSTEDT，目录号：82.1472）
甲。 thaliana 种子（在这种情况下是生态型Columbia，Col-0）
注意：拟南芥种子在4℃下不超过6个月。
电子。具有选择性质粒（在这种情况下为pCambia5105 / pCambia5106质粒[Jefferson等人，2006]）的菌株OV14菌株
70％乙醇
蒸馏无菌水（DSW）
漂白剂（5％次氯酸钠;最终浓度为50％漂白剂，即1：1漂白剂：水）
Tween-20
琼脂糖（0.1％，Sigma-Aldrich，目录号：A9539-500G）
细菌选择抗生素：卡那霉素，链霉素，壮观霉素（Duchefa Biochemie）
氯化钠（0.9％NaCl溶液）
Acetosyringone（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
头孢噻肟钠（Duchefa Biochemie，目录号：C0111.0005）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
氯化钙脱水（Duchefa Biochemie，目录号：C0504）
琼脂1号（Oxoid，目录号：LP0011）
MS基础盐（Duchefa Biochemie，目录号：M0221）
蔗糖（Duchefa Biochemie，目录号：S0809）
2,4-吗啉代 - 乙磺酸（MES一水合物）（Duchefa Biochemie，目录号：M1503）
肌醇（Duchefa Biochemie，目录号：I0609）
烟酸（Duchefa Biochemie，目录号：N0611）
吡哆素（Duchefa Biochemie，目录号：P0612）
硫胺素-HCl（Duchefa Biochemie，目录号：T0614）
D-葡萄糖一水合物（Duchefa Biochemie，目录号：G0802）
吲哚-3-乙酸（IAA）（Duchefa Biochemie，目录号：I0901）
2,4-二氯代苯氧基乙酸（2,4-D）（Duchefa Biochemie，目录号：D0911）
Kinetin（Duchefa Biochemie，目录号：K0905）
X-GlcA环己基铵盐（Duchefa Biochemie，目录号：X1405）
二甲基亚砜（DMSO）（Duchefa Biochemie，目录号：D1370）
Teagasc-Tryptone酵母提取物（TTY）培养基（Rathore et al。，2015）（见配方）
基于MS的媒体（见配方）
1. 种子发芽媒体（SGM）
2. 共培养媒体（CCM）
3. 愈伤组织诱导培养基（CIM）
4. 维生素库存
X-GlcA溶液（参见食谱）
组织化学GUS染色溶液（Jefferson等人，1987）（参见食谱）

设备

移液器（P1000，P100，P10）
控制环境室/室可以健康发展。（24℃，16小时光照，8小时黑暗），缩写为CT室
锥形瓶（250毫升，无菌）
离心机
培养箱（28°C和37°C）
摇床培养箱（28°C，220 rpm）
冰箱（4°C）和冷柜（-20°C和-80°C）
层层流动执行无菌工作
珠子消毒器/火焰消毒镊子
Scalpel刀片柄（No.7 S / S，Swan Morton，目录号：0907）
高压灭菌器（121°C和15 psi）15分钟）
pH计
称重平衡
NanoDrop2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000）
Elga净水器（Veolia Water Solution＆amp; Technologies，型号：PURELAB OPTION-R 7，目录号：OR007BPM1）
立体显微镜

软件

SAS系统（版本9.3，SAS Institute Inc.版权所有，2002-2010，Cary，NC，USA）

程序

种子灭菌和发芽
1. 在具有70％乙醇（EtOH）的2ml试管中，通过涡旋管将表面消毒拟南芥种子（〜5mg）2分钟。用可调微量移液管（1000μl）弃去EtOH，用DSW洗涤两次。所有步骤均在层流罩下进行，以确保无菌条件。
2. 向种子中加入含有0.1％Tween-20的50％漂白液，并剧烈振荡灭菌10分钟。一旦完成，用1000μl微量移液管滗出漂白剂（图1A）
3. 用DSW冲洗种子五次，以清除任何残留的漂白剂。
4. 灭菌后，加入0.1％琼脂糖（先前在121℃高压灭菌15分钟），使种子易于处理。
5. 使用微量移液管（1,000μl），每滴放置约4粒种子，每行一滴，距离包含基于MS的种子发芽培养基（SGM，参见食谱）的方形培养皿（图1B和1C）顶端离离约1英寸的距离，。使用Parafil双重包装Petri菜。
6. 在设置在24℃，16小时光照〜4,000勒克斯光周期和8小时黑暗中的15-20天的CT（控制温度）室中垂直孵育培养皿（以确保细根形成）（图1D）。
7. 在根到达菜的末端之前应该实现根收获，在该阶段〜每株植株需要0.5厘米长度。
  
  图1.拟南芥种子灭菌和萌发。：一种。在2ml离心管中的50％漂白液中的拟南芥生态型Col-0; B.将灭菌的种子放置在方形培养皿上，留下约1英寸的顶部空间用于植物生长; C. SGM上的种子; D. CT房间垂直排列的培养皿（24°C，16 h光周期），显示有根的小植物。
准备接种物接种物
1. 成长E在含有100mg / L卡那霉素，200mg / L链霉素和200mg / L壮观霉素的TTY琼脂（参见食谱）上的OV14_pCambia5105（这里是E5105），以选择含有T-DNA的单质粒，以及毒素（ vir ）基因在28°C过夜（图2A）
2. 挑取单个菌落，在无菌锥形瓶中接种含有适当抗生素（100mg / L卡那霉素，200mg / L链霉素和壮观霉素）的10ml TTY肉汤，并在28℃和220rpm下生长过夜，达到0.8 OD 600nm（图2B和2C）。
3. 通过离心将细胞置于50ml Falcon管中，用0.9％NaCl洗涤以除去任何抗生素残留物。将细菌培养物以3,750×g（rcf）离心25-30分钟用于接种物制剂。将细胞重新悬浮在0.9％NaCl中以维持0.8 OD 600 nm（图2D）。
4. 加入200μM乙酰丁香酮，并在28℃，220rpm下孵育另外1.5小时以诱导毒力。
  
  图2.用于转染根部的E5105培养物的制备步骤 A.在含有100mg / L卡那霉素+ 200mg / L链霉素+ 200mg / L壮观霉素的TTY琼脂上过夜生长E5105，得到单个殖民地。 B.使用适当的抗生素在TTY肉汤中产生单个菌落来源的E5105培养物。 C.E5105培养在50ml Falcon管中，用于离心以除去TTY肉汤+抗生素。 D.E5105重悬于0.9％NaCl中，补充200μM乙酰丁香酮以在28℃，1.5小时诱导感染。
拟南芥根系的准备和转染
1. 分开 A。在使用无菌手术刀叶片的植物根部从根部放下含有少量（〜500μl）DSW的培养皿，以确保足够的根部水合（图3A和3B）。
2. 将根对齐并切成0.3至0.5厘米长的段（图3C）。在含有200μM乙酰丁香酮的MS基础培养基（CCM，参见食谱）上放置约30个根部的束。
3. 使用P1000移液器在每个 A上放置2-3滴E5105。 thaliana 根束，并允许10分钟的转染时间（图3D）。未处理的根部（无细菌）应用作阴性对照。
4. 使用P1000移液管在10分钟的转染时间后，除去任何多余的细菌溶液。双面包裹石蜡玻璃。
5. 共培养细菌，而A。 thaliana 根在20°C，黑暗中5天。
  
  图3.拟南芥植物和接种的处理。：一种。将拟南芥植物从SGM移植到包含DSW的方形培养皿; B.将根与芽分开; C.切割A. thaliana 根到〜3毫米段; D.使用E5105后1.5小时接种根部段感染。

瞬时GUS表达测定
1. 邮政5天合作;在含有500mg / L头孢噻肟的DSW中洗涤处理/未处理的根部段以减轻细菌过度生长。
2. GUS染色：使用以下两种方法之一，如Jefferson等人（1987）所述进行推定的转基因根节段中β-葡糖醛酸糖苷酶的活性：
  1. 为了更快的结果，将洗涤的根在GUS染色溶液（参见食谱）中在37℃下过夜孵育处理。为了去除多余的污渍，洗涤90％（v / v）乙醇中的根部分（图4A和4B）
  2. 为了进一步增殖根部并促进易于处理，将根转移到含有250mg / L头孢噻肟的愈伤组织诱导培养基（CIM，参见食谱）上。用Parafilm密封板，并在24℃下在黑暗中孵育5-6天，然后在GUS染色溶液中染色，37℃过夜（图4C和4D）。
    
    图4.通过E-ART的组织化学GUS活性根部分段在5天共培养（A）未处理对照和（B）用E5105处理后立即转移到GUS染色体上。（C）未经处理的对照组和（D）用E5105处理，将片段转移至含有250mg / L头孢噻肟的CIM（C）未处理对照组（D）处理6天时，显示愈伤组织形成（表示为红色箭头）的根部段的GUS染色。