材料和试剂

10厘米直径的聚苯乙烯培养皿（Fisher Scientific，目录号：12654785）
Parafilm M多用途石蜡蜡（Bemis，目录号：PM996）
甜食青椒水果由先正达种子S.A.（El Ejido，西班牙）提供
注意：该公司在最佳的光照，温度和湿度条件下，在实验玻璃覆盖的温室中种植胡椒植物。
拟南芥生态型哥伦比亚种子（最初来自NASC，诺丁汉拟南芥库存中心）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：10517694）
商业漂白（20％）
Murashige和Skoog培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
植物琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：P8169-100G）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
牛血清白蛋白（BSA）级分V（Roche Diagnostics，Sigma-Aldrich，目录号：10735078001）
4-20％预制TGX微型蛋白凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：4561093）
抗坏血酸（AsA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7631-25G）
氯化铜（I）（CuCl）（Sigma-Aldrich，目录号：651745-5G）
N-马来酰亚胺（NEM）（Sigma-Aldrich，目录号：E3876-5G）
二硫苏糖醇（DTT）（Roche Diagnostics，目录号：10708984001）
还原型谷胱甘肽（GSH）（Sigma-Aldrich，目录号：G4251-5G）
β-巯基乙醇（ME）（Sigma-Aldrich，目录号：M6250-10ML）
Tris（AMRESCO，目录号：0497）
乙二胺四乙酸二钠盐，二水合物（Na 2 -EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
甘油（AMRESCO，目录号：E520）
十二烷基硫酸钠（SDS;电泳级）
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126-25G）
3-氨基-4-氨基甲基-2'，7'-二氟荧光素（DAF-FM）（Sigma-Aldrich，目录号：D2196）
研磨缓冲液（参见食谱）
样品处理缓冲液（2x）（参见食谱）
含有1mM EDTA的SDS-PAGE的标准运行缓冲液（参见食谱）
凝胶染色溶液（参见食谱）

设备

一套Gilson微量移液器（Gilson，P10，P20和P100）
植物生长箱（Panasonic Biomedical，型号：MLR-352-PE）
瓷砂浆和杵（VWR，目录号：分别为410-0110和410-0120）
冷藏离心机Hettich Mikro 220R（Hettich Lab Technology，型号：Mikro 220 R，目录号：2205）
垂直平板凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN ®，目录号：1658003EDU）
标准紫外 - 透射仪（302-312 nm），用于分子生物学实验室
分子成像仪PharosFX系统（Bio-Rad Laboratories，型号：PharosFX TM，目录号：1709460）
注意：本产品已停产。
进行 TM 201紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Evolution TM， 201，目录号：912A0890） />

软件

ImageJ（ https://imagej.net/ 中提供的免费应用程序）

程序

植物提取物的制备

甜瓜青椒（ Capsicum annuum ）水果由先正达种子S.A.（El Ejido，西班牙）从在实验温室种植的植物提供，其中最佳营养补充施用于作为底物的木材上。
在70％含有0.1％SDS的乙醇中表达消毒拟南芥生态型Columbia种子5分钟。然后，放入含有20％（v / v）商业漂白剂和0.1％SDS的无菌水中20分钟。用无菌水洗涤四次。在含有1％（w / v）蔗糖和0.8％（w / v）植物琼脂的pH5.5下，在商业Murashige和Skoog培养基（Sigma-Aldrich）上培养Petri板上的种子。将幼苗放置16小时，光照时间为16小时，22℃/ 8小时黑暗，18℃，光强度为100微米/秒〜。
在研钵和研杵与研钵缓冲液（参见食谱）中使植物样品（0.1至0.5g）以1:1比例（w / v）和胡椒果实比例1:3（w / v）拟南芥。在0-4°C进行这些操作，例如使用带冰的容器（见图1）

图1.说明性图片显示冰箱中的砂浆的配置
离心机在4℃下以27,000×g离心提取20分钟
使用上清液进行蛋白质分析。用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）测定蛋白质浓度，使用牛血清白蛋白作为标准，按照制造商概述的“微量测定法”（< br />

SDS-PAGE和亚硝基硫醇染色
1. 使用预先的4-20％梯度TGX Mini-Protean凝胶（无样品）进行SDS-PAGE预处理30分钟，每个凝胶30 mA，标准运行缓冲液含有1 mM EDTA。注意：凝胶预先主要用于去除任何潜在痕量的未聚合丙烯酰胺。
2. 以比例1：1（v / v）准备样品处理缓冲液（见配方）的样品。对于每个样品，每泳道加载25μg蛋白质
3. 运行电泳每凝胶15 mA。当溴酚蓝（用于追踪样品的迁移）指示的前线距离凝胶末端1cm（通常为45〜60分钟）时，应停止电泳。
4. 用含有1mM EDTA的20-25ml超纯水洗涤凝胶5分钟
5. 将凝胶用凝胶染色溶液（28μMDAF-FM）在室温下黑暗涂覆10分钟。
  注意：盖上一块相同尺寸的石蜡膜，并使用滚筒将凝胶上的染色溶液轻轻平滑，使溶液均匀分布。
6. 将凝胶暴露于紫外光下5分钟
7. 根据制造商的说明书（激发波长488 nm，发射波长530 nm），使用荧光成像仪（PharosFM TM ）拍照（见图2）。
  
  图2.植物样品中的S - 亚硝基化蛋白质的检测和定量。：一种。在DAF凝胶上检测内源性的S - 亚硝基化（亚硝化）蛋白（SNP）。车道1.甜青椒水果; Lane 2。拟南芥 14日龄幼苗。在非还原条件下，通过SDS-PAGE（梯度凝胶4-20％）分离蛋白质样品（25μg）。分子量标记在右侧显示。 B.图像质量分数蛋白质的光密度扫描及其相对量化（％）ImageJ程序制作

数据分析

可通过光密度分析（例如使用ImageJ程序）（见图2B）进行定量鉴定。

笔记

任何技术都可能会有误报。因此，强烈建议执行多个内部控制，以避免新植物样品中的潜在伪像。在将样品加样到DAF凝胶之前，建议将植物样品在25℃预处理3小时，并使用不同的化学物质：A）分解SNO，如20mM抗坏血酸（AsA）和0.1mM CuCl; B）封闭游离硫醇，例如5mM N，N-乙基马来酰亚胺（NEM）;和C）还原剂，例如20mM二硫苏糖醇（DTT），20mM还原型谷胱甘肽（GSH）和100mMβ-巯基乙醇（ME）。

食谱

研磨缓冲液
50mM Tris-HCl，pH7.7
0.1 mM EDTA
0.2％（v / v）Triton X-100
10％（v / v）甘油
样品处理缓冲液（2x）
250mM Tris-HCl，pH6.8
8％（w / v）SDS
40％（w / v）甘油
0.006％（w / v）溴酚蓝
含有1 mM EDTA的SDS-PAGE标准运行缓冲液运行缓冲液：0.375mM Tris-HCl，pH8.8。
1 mM EDTA
凝胶染色溶液
28μMDAF-FM溶液用超纯水制备
注意：使用前准备并保护灯光。

致谢

MRR承认西班牙经济与竞争力部的FPI合同（BES-2012-055904）。这项工作得到西班牙经济和竞争力部的经济和社会发展部的共同出资赠款AGL2015-65104-P的支持。作者还对以前的King等人的工作感激不尽。（2005）已经很有价值地适应了植物样本。

参考

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