材料和试剂

移液管吸头，1,000μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：2179-HR）}
移液瓶头，200μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：2069-HR）}
移液瓶头，20μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：2149P-HR）}
移液瓶头，10μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：2140-HR）}
手术胶带（3M，目录号：1527-0）
8-0编织丝（NATSUME SEISAKUSHO，目录号：M6-80B2）
5-0编织丝（NATSUME SEISAKUSHO，目录号：ER12-50B1）
10ml注射器（TERUMO，目录号：SS-10ESZ）
23号针（TERUMO，目录号：NN-2332R）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：339652）}
6厘米盘（康宁，目录号：430589）
手术刺血针（秋山医疗MFG，目录号：FB10）
70μmEASYstrainer ^{TM （Greiner Bio One International，目录号：542070）}
10厘米未经处理的菜（Corning，目录号：430591）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：339650）}
8孔滑动室（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：154534）}
盖玻璃（松本玻璃，目录号：C024601）
0.22μmMinisart ^{®过滤器（Sartorius，目录号：16534-K）}
野生型C57BL / 6JJmsSlc小鼠（日本SLC）
L929细胞（National Institutes of Biomedical Innovation，Health and Nutrition，Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank，目录号：JCRB9003）
戊巴比妥（Somnopentyl）（Kyoritsu Seiyaku，目录号：SOM02-YA1312）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（NACALAI TESQUE，目录号：14249-95）
红细胞（RBC）裂解缓冲液（Roche Diagnostics，目录号：11814389001）
胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（NACALAI TESQUE，目录号：35554-64）
多聚甲醛（PFA）（NACALAI TESQUE，目录号：26126-25）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Dojindo，目录号：340-07971）
FluorSave ^{TM （默克，目录号：345789）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153-100G）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4799-5G）
胶原酶A（Roche Diagnostics，目录号：10103586001）
无血清DMEM（NACALAI TESQUE，目录号：08458-16）
青霉素链霉素（NACALAI TESQUE，目录号：09367-34）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
CellTracker 绿色5-氯甲基荧光素二乙酸酯（CMFDA）染料（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C7025）}
Z-VAD-FMK（Z-Val-Aal-Asp（OMe）-CH 2 F）（PEPTIDE INSTITUTE，目录号：3188-v）
hTNF-α（PeproTech，目录号：300-01A）
聚-L-赖氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
水（NACALAI TESQUE，目录号：06442-95）
致命的牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437028）}
胶原酶A溶液（参见食谱）
培养基（见食谱）
10 mM CMFDA染料（见食谱）
10 mM Z-VAD-FMK（见配方）
10μg/ ml hTNF-α溶液（参见食谱）
涂有聚-L-赖氨酸的8孔滑动室（参见食谱）

设备

移液管1000μl（Gilson，目录号：F123602）
移液器200μl（Gilson，目录号：F123601）
移液器20μl（Gilson，目录号：F123600）
移液2μl（Gilson，目录号：F144801）
呼吸器（Shinano Manufacturing，目录号：SN-480-7X2T）
光学显微镜（Olympus，型号：SZX7）
手术工具如镊子（工具可以从NATSUME SEISAKUSHO和MEISTER购买）
剪刀（NATSUME SEISAKUSHO，目录号：B-12）
洁净台（Panasonic Healthcare，型号：MCV-B131S）
水浴（TAITEC，型号：Personal-11）
离心机（TOMY SEIKO，型号：LC-200）
CO 2培养箱（SANYO，型号：MCO-18AIC）
荧光显微镜（KEYENCE，型号：BZ-9000）

软件

BZ-II图像分析应用（KEYENCE CORPORATION）

程序

方法A和B也适用于通过心脏巨噬细胞和心肌成纤维细胞（Horii等人，2017）测定凋亡细胞吞噬作用的测定法。

通过外科手术建立MI小鼠模型
1. 准备8至10周龄的雄性野生型小鼠C57BL / 6J。
2. 为了麻醉小鼠，腹腔注射戊巴比妥（50mg / kg）。
3. 用手术胶带将鼠标固定在背面。
4. 使用呼吸器进行人工呼吸（呼吸空气量：0.5cc，呼吸频率：120 bpm）。
5. 在光学显微镜下，手术打开胸部并用无菌手术工具暴露心脏
6. 使用8-0编织丝来执行左冠状动脉的永久闭塞（见视频1）
7. 使用5-0编织丝来关闭胸部。
8. 手术后，给予老鼠适当的治疗，并保持温暖，直到康复。
  
  Video 1. How to establish an MI mouse model
从MI小鼠模型中分离心肌肌成纤维细胞
1. 通过腹膜内注射施用戊巴比妥（150mg / kg），在MI手术3天后使两只小鼠安乐死。
2. 用无菌剪刀打开胸部露出心脏。
3. 切开右心房，用10ml注射器装入10ml冰冷的PBS，并用23号针头装上左心室。
4. 用10ml冰冷的PBS清洗心脏。
5. 收集心脏，并去除心房。
6. 将心放在含有10ml冰冷PBS的50ml管中，以保存其他小鼠。
7. 弃上清液，加入5ml冰冷的PBS
8. 将心脏与PBS一起转移到干净的工作台上的50ml管中的6厘米盘中
9. 用两只手术刀将每颗心脏切成15个小块，同时将其保持在冰上。
10. 丢弃PBS。
11. 洗心粉，洒上5ml的PBS。
12. 重复步骤B10-B11。
13. 将心脏碎片转移到50ml管中，并移除PBS。
14. 加入4ml胶原酶A溶液（参见食谱）到管中
15. 将包含切碎的心脏和胶原酶A溶液的混合物的管在37℃的水浴中孵育，同时以120rpm摇动10分钟。
16. 丢弃含有许多造血细胞的上清液
17. 再次重复步骤B14-B16。
18. 将4ml胶原酶A溶液加入到现在含有残留物质的管中
19. 将含有切碎的心脏和胶原酶A溶液的混合物的管在120rpm和37℃的水浴中孵育10分钟。
20. 将含有分离细胞的上清液通过70μmEASYstrainer ^{TM 通入新的50ml管中。}
21. 在室温下将收集的细胞悬液以300×g离心5分钟，弃去上清液。
22. 将1ml培养基（见食谱）加入细胞沉淀中，并保持在冰上
23. 重复步骤B18-B22，总共八次。
24. 八次搅动后，将所有细胞悬浮液（1 ml x 8）合并到一个新的50ml管中
25. 以300×g离心该细胞悬浮液5分钟，离心后丢弃上清液。
26. 将细胞沉淀悬浮在1ml RBC裂解缓冲液中，并在室温下孵育1分钟
27. 将9 ml培养液加入细胞悬浮液中
28. 以300×g离心细胞悬浮液5分钟，离心后弃去上清液。
29. 将细胞沉淀悬浮在10ml的培养基中
30. 将该细胞悬浮液在10厘米未经处理的培养皿上铺板，并在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育过夜。
31. 孵育过夜后，弃去培养基，加入10ml新鲜培养基
32. 培养分离的心脏细胞超过6天。
  注意：肌成纤维细胞附着在板上;通过改变培养基来除去包括造血细胞在内的未附着的污染细胞。当肌纤维母细胞达到融合前，通过它们。
33. 在进行体外吞噬试验前一天，从培养皿中弃去培养基，并用10ml PBS洗两次。
34. 加入1ml胰蛋白酶/ EDTA，37℃孵育1分钟
35. 加入9ml培养基，并将细胞悬浮液转移到15-ml管中
36. 以300×g离心细胞悬浮液5分钟，离心后弃去上清液。
37. 加入10ml的培养基，悬浮细胞沉淀
38. 计数细胞数，并通过添加培养基将其调整为1×10 5个细胞/ ml。
39. 将200μl该细胞悬浮液加入到涂有聚-L-赖氨酸（2×10 4个/孔）的8孔载玻片室中，参见Recipes）。
40. 在5％CO 2培养箱中于37℃孵育过夜。
坏死性L929细胞的制备
1. 在含有培养基的10cm未经处理的培养皿上种子2.5×10 6 L929细胞。
2. 在5％CO 2培养箱中于37℃孵育过夜。
3. 吸入培养基，并使用10ml无血清DMEM洗涤两次。
4. 加入10ml含有10μl10mM CMFDA染料的无血清DMEM（见配方）（最终浓度为10μM）。
5. 在5％CO 2 /培养箱中37℃孵育30分钟
6. 吸入培养基，并在冰上孵育1分钟
7. 使用10ml的培养基洗涤4次。
8. 加入10ml含有20μl10mM Z-VAD-FMK的培养基（参见食谱）（终浓度为20μM）。
9. 在CO _{2 孵育箱中孵育2小时。}
10. 加入10μl10μg/ ml hTNF-α溶液（见配方）（终浓度为10 ng / ml）。
11. 在5％CO 2培养箱中于37℃孵育4小时。
12. 将上清液转移到50ml管中注意：上清液含有坏死性L929细胞。
13. 以300×g离心细胞悬浮液5分钟，离心后弃去上清液。
14. 加入10ml的培养基
15. 完全重复步骤C13和C14三次。
16. 计数单元格编号。
17. 用培养基将细胞数调整至1×10 6细胞/ ml
吞噬试验
1. 在37℃的5％CO 2培养箱的8孔载玻片室中准备用200μl培养基每孔培养的心肌成纤维细胞（该载玻片在B40中制备） >
2. 丢弃上清液。
3. 加入浓度为1×10 6细胞/ ml（2×10 5个细胞/孔）的200μlCMFDA标记的神经细胞L929细胞。
  注意：吞噬的坏死细胞数量是每孔吞噬细胞数量的10倍。
4. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育3小时。
5. 弃去上清液，用200μlPBS洗3次注意：未吞噬的坏死细胞附着于吞噬细胞，通过用PBS洗涤除去这些细胞。
6. 为了固定细胞，加入200μl的1％PFA / PBS溶液，并在室温下孵育15分钟。
7. 弃去上清液，用200μlPBS洗涤
8. 弃去上清液，并从玻璃载玻片上取下室壁。
9. 用含有0.1％DAPI的FluorSave ^{TM 试剂安装载玻片，并在玻璃载玻片上放置盖玻璃。}
10. 在相位和荧光显微镜下观察注意：BZ-9000以20倍的倍率捕获图像。获取相位对比图像以及使用GFP-BP和DAPI-BP滤镜捕获的图像。

数据分析

从12-15个随机选择的字段中捕获三种类型的图像（相位图像以及使用GFP-BP和DAPI-BP滤镜获取的图像）（图1）。
使用BZ-II图像分析应用程序合并图像。
计数吞噬细胞和吞噬细胞（CMFDA阳性和合并吞噬细胞）的数量。
注意：在相位对比图像中，可以以光相和模糊图像的形式观察未受影响的细胞，而吞噬细胞可以以暗相图像的形式观察。不要将这些光相细胞视为吞噬细胞。
计算吞噬指数（图1）注意：吞噬指数定义为每个吞噬细胞吞噬细胞的数量。首先，计数由DAPI（粉红色箭头）染色的肌成纤维细胞的核数，然后计数用CMFDA（黄色箭头）标记的被吞噬的坏死细胞数。计数后，吞噬指数计算为吞噬的尸检细胞数除以肌成纤维细胞核数。例如，当肌成纤维细胞核数为11，吞噬细胞数为5时，吞噬指数计算为5/11 = 0.45。计算后，吞噬指数在12-15个随机选择的字段中平均。

图1.心肌肌成纤维细胞吞噬坏死细胞。手术后3天，从MI小鼠模型中分离出心肌肌成纤维细胞。坏死性L929细胞用CMFDA（绿色）标记。箭头的图片被重新缩放，以便更好地显示吞噬作用。计数吞噬细胞（粉红色箭头）和吞噬细胞（黄色箭头）的数量，并计算吞噬指数。刻度棒=50μm。

食谱

胶原酶A溶液
1. 取50ml PBS加至50ml管中
2. 添加：
  50毫克BSA
  50毫克胰蛋白酶
  50毫克胶原酶A
3. 混匀，室温下孵育
4. 通过0.22μmMinisart ^{®过滤器
  过滤溶液}
培养基
1. 从500毫升无血清DMEM中除去55毫升无血清DMEM
2. 加入50ml FBS
3. 加入5ml青霉素 - 链霉素
10 mM CMFDA染料
加入10.76μl的DMSO至50μg的CMFDA染料
10 mM Z-VAD-FMK
加入240微升DMSO至1.1毫克Z-VAD-FMK
10μg/ ml hTNF-α溶液
1. 将10ml无菌蒸馏水加入到15 ml管中
2. 加入10毫克BSA
3. 通过0.22μmMinisart过滤器过滤溶液，制成0.1％BSA溶液
4. 加入100μl0.1％BSA溶液至10μghTNF-α，制成100μg/ ml hTNF-α溶液，
5. 向100μl/ ml的hTNF-α溶液中加入0.1μl的BSA溶液90μl
涂有聚-L-赖氨酸的8孔载玻片室
1. 加入200μl聚-L-赖氨酸溶液到8孔幻灯片室
2. 在CO _{2 孵育器中孵育3小时}
3. 丢弃聚-L-赖氨酸溶液
4. 使用PBS清洗

致谢

使用此协议时，请参阅M Nakaya等人。（2017）J Clin Invest。资助由日本教育，文化，体育，科学和技术部（MEXT）[M.N（17H03984）]提供;来自MEXT [到M.N（17H05510）]的创新领域科学研究资助（各类细胞死亡的稳态调节）]。所有动物实验均按照九州大学的指导方针进行。

参考

Horii，Y.，Matsuda，S.，Watari，K.，Nagasaka，A.，Kurose，H。和Nakaya，M。（2017）。＆lt; a class =ke-insertfile"href =http： /www.bio-protocol.org/e2553target ="_ blank>确定心脏巨噬细胞和心肌成纤维细胞对凋亡细胞的吞噬作用的测定。生物原型7（18）： e2553。
Nakaya，M.，Watari，K.，Tajima，M.，Nakaya，T.，Matsuda，S.，Ohara，H.，Nishihara，H.，Yamaguchi，H.，Hashimoto，A.，Nishida， Nagasaka，A.，Horii，Y.，Ono，H.，Iribe，G.，Inoue，R.，Tsuda，M.，Inoue，K.，Tanaka，A.，Kuroda，M.，Nagata， Kurose，H。（2017）。心肌肌成纤维细胞吞噬死亡细胞有助于心肌梗死后恢复。 J Clin Invest 127（1）：383-401。