材料和试剂

0.2ml PCR管（Biosharp，目录号：BS-02-P）
1.5ml Eppendorf管（Biosharp，目录号：BS-15-M）
移液器吸头（Biosharp，目录号：BS-10-T，BS-200-T，BS-1000-T）
主管人员大肠杆菌DH5α细胞（自制）
pTX171质粒（Addgene，目录号：89258）
pTX172质粒（Addgene，目录号：89259）
Bsa I（New England Biolabs，目录号：R0535L）
去离子水（无菌）
琼脂糖（Biowest，目录号：111860）
溴化乙锭（Solarbio Life Scientific，目录号：E1020）
AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒（Corning，Axygen ，目录号：AP-GX-250）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
dNTPs混合物（Tiangen Biotech，目录号：CD117-11）
Taq DNA聚合酶（Tiangen Biotech，目录号：ET101-01-02）
Q5 ®高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491L）
AxyPrep TM质粒Miniprep试剂盒（Corning，Axygen，目录号：AP-MN-P-250）
卡那霉素（Solarbio Life Scientific，目录号：K8020）
TAE电泳缓冲液（参见食谱）
Tris（Solarbio Life Scientific，目录号：T8060）
乙酸（Kelong）
0.5M EDTA（Solarbio Life Scientific，目录号：E1170）
LB培养基（见食谱）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
氯化钠（NaCl）（Kelong）

设备

移液器（龙实验室）
加热块（杭州Allsheng Instruments，型号：MK-20）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Arktik TM 热循环仪）
水浴（永光明，型号：DZKW-S-4）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
DNA电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub Cell GT Systems）
NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：NanoDrop TM 2000）

程序

设计sgRNA以靶向感兴趣的基因
1. 使用在线sgRNA设计工具（如CRIPSR-P v2.0）（ http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/ ）; CRISPR RGEN工具（ http://www.rgenome.net/cas-offinder / ）; E-CRISP（ http：//www.e- crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html ）。这些是可用于sgRNA设计的几种基于Web的工具。它们在sgRNA设计和非目标预测中主要具有相同的功能。主要区别是评分系统的算法。
  注意：在Cas9切割位点含有限制酶位点的sgRNA靶标将有助于使用聚合酶链反应限制性内切核酸酶消化测定鉴定突变体。

sgRNA寡核苷酸退火

将10μl的每个sgRNA的正向和反向寡核苷酸（100μM）混合在分开的微管中
在加热块或热循环仪中将微管在95℃孵育5分钟。
让微管缓慢冷却至室温。
用去离子水稀释退火的混合物1：200

矢量克隆
可以使用两种方法将sgRNA克隆入STU CRISPR-Cas9表达载体：切割和连接或金门法（图2）。这两种方法在包括Bsa I消化和T4DNA连接酶连接在内的方法中是相同的。金门反应更容易，因为消化和连接将在一个PCR管中处理，可能会节省一些时间。

图2.在协议
中描述的克隆程序的示意图

切割和结扎
1. 使用Bsa I将STU CRISPR-Cas9质粒pTX171或pTX172线性化。在37℃孵育2-4小时。
2. 将消化产物负载到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化消化的载体，并使用NanoDrop定量DNA浓度。
3. 将稀释退火的寡核苷酸连接成线性化的STU CRISPR-Cas9表达载体，在16℃过夜或室温孵育1-2小时。
4. 将5μl反应转化为50μl感受态DH5ɑ细胞，将转化的细胞扩增到补充有50 mg / L卡那霉素的LB平板上，然后在37°C孵育过夜。
5. 通过菌落PCR和Sanger测序验证阳性克隆。
金门法（确保退火的sgRNA寡核苷酸不包含Bsa I位点）
1. 建立一个金门反应，将sgRNAs克隆入STU Cas9表达载体。
2. 使用以下程序在热循环仪中孵育金门反应：在37℃下5分钟和16℃10分钟的10个循环，然后加热至37℃另外5分钟和80℃10分钟。 />
3. 将5μl的反应转化成50μl感受态的DH5α细胞，将转化的细胞在补充有50mg / L卡那霉素的LB平板上扩增，然后在37℃下孵育过夜。
4. 通过菌落PCR和Sanger测序验证阳性克隆。可以使用正向sgRNA寡核苷酸（例如，参见步骤A2）和ZY065-RB：（5'-ttctaataaacgctcttctct-3'）进行集落PCR。预期的产品大小约为230bp。 ZY065-RB可用于排序。

两个sgRNA可以克隆到STU CRISPR-Cas9表达载体中，同时靶向两个位点（图2）。

设计两个底漆如下：
Bsa I-sgRNA01-F：5'-CA GGTCTC ACGGA- N20 -gttttagagctagaaatagcaagttaa-3'
Bsa I-sgRNA02-R：5'-TC GGTCTC CAAAC- N20 -tccggtgacaaaagcaccga-3'
GGTCTC 是Bsa I识别序列;
' N20 '与sgRNA01目标特异性序列相同;
' N20 '是sgRNA02目标特异序列的相反补体;
小写字母与STU CRISPR-Cas9表达载体互补。
注意：强烈建议使用PAGE纯化的寡核苷酸，脱盐也可以。
设置50μlPCR反应以扩增STU CRISPR-Cas9表达载体构建的DNA
使用以下程序在热循环仪中运行PCR：
将PCR产物加载到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用AxyPrep TM凝胶提取试剂盒纯化PCR产物，并使用NanoDrop定量DNA浓度。
建立一个金门反应，将两条sgRNA克隆入STU CRISPR-Cas9表达载体
使用以下程序在热循环仪中孵育金门反应：在37℃下5分钟和16℃10分钟的10个循环，然后加热至37℃另外5分钟和80℃10分钟。 />
将5μl反应产物转化成50μl感受态DH5α细胞，将转化的细胞在补充有50mg / L卡那霉素的LB平板上扩增，然后在37℃下孵育过夜。
通过菌落PCR和Sanger测序验证阳性克隆。

我们的STU CRISPR-Cas9系统具有多重位点基因组编辑的潜力。对于一个STU CRISPR-Cas9载体中的两个以上的位点，可以进行双向PCR以将不同的sgRNA克隆到表达载体中（图2）。

设计底稿如下：
Bsa I-sgRNA01-F：5'-CA GGTCTC ACGGA- N20 -3'
sgRNA01-F：5' - N20 - gttttagagctagaaatagcaagttaa -3'
sgRNA02-F：5' - N20 - gttttagagctagaaatagcaagttaa -3'
sgRNA02-R：5' - N20 -tccggtgacaaaagc accga -3'
...
sgRNA（n-1）-F：5' - N20 - gttttagagctagaaatagcaagttaa -3'
sgRNA（n-1）-R：5' - N20 -tccggtgacaaaagc accga -3'
sgRNA（n）-R：5' - N20 -tccggtgacaaaagc accga -3'
Bsa I-sgRNA（n）-R：5'-TC GGTCTC CAAAC- N20 -3'
GGTCTC 是Bsa I识别序列;
“N20”与目标特定序列相同;
'N20 是目标特异性序列的反向互补;
不同的颜色表示不同的目标特定序列（例如， N20 ， N20 ， N20 ， N20 ）。
小写字母与STU CRISPR-Cas9表达载体互补。
设置1个 st 循环PCR反应以使用引物对（sgRNA01-F / sgRNA02-R，sgRNA02-F / sgRNA03-R ... sgRNA（n-1） - 侧翼的核酶切割位点扩增sgRNA片段F / sgRNA（n）-R）
使用以下程序在热循环仪中运行PCR：
将PCR产物加载到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用AxyPrep TM凝胶提取试剂盒纯化PCR产物，并使用NanoDrop定量DNA浓度。
设置2个 nd 圆形PCR反应，将不同的sgRNA与核酶切割位点连接成一个片段。
使用以下程序在热循环仪中运行PCR：
将PCR产物加载到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用AxyPrep TM凝胶提取试剂盒纯化PCR产物，并使用NanoDrop定量DNA浓度。
建立一个金门反应，将多重sgRNA片段克隆到STU CRISPR-Cas9表达载体中。
使用以下程序在热循环仪中孵育金门反应：在37℃下5分钟和16℃10分钟的10个循环，然后加热至37℃另外5分钟和80℃10分钟。 />
将5μl反应产物转化成50μl感受态DH5α细胞，将转化的细胞在补充有50mg / L卡那霉素的LB平板上扩增，然后在37℃下孵育过夜。
通过菌落PCR和Sanger测序验证阳性克隆。

数据分析

在原始论文（Tang等人）中可以找到STU CRISPR-Cas9系统应用的实例，包括基因编辑和基因缺失以及水稻，烟草和拟南芥中的测序数据。 2016; 链接到论文）。此外，程序图以及基因组编辑和sgRNA多重构建的实例也可以在原始研究论文（Tang等人，2016）中找到。

笔记

如果使用Golden Gate方法无法获得殖民地，则将周期数增加到15-20次。
我们在几种生物（包括水稻，烟草和拟南芥）中测试了STU CRISPR-Cas9系统，并成功实现了有效的基因组编辑。

食谱

50倍TAE电泳缓冲液
242g / L Tris
57.1ml / L乙酸
100 ml / L 0.5 M EDTA（pH 8.0）
LB培养基
10g / L胰蛋白胨
10g / L NaCl
5克/升酵母提取物

致谢

Y.Z.获得中国国家科学基金（31330017和31371682），四川青年科技基金（2017JQ0005）和中央大学基础研究基金（ZYGX2016J119和ZYGX2016J122）的资助。该协议是基于我们以前在Molecular Plant（Tang等人，2016）发表的研究开发的。

参考

Gheysen，G.，Herman，L.，Breyne，P.，Gielen，J.，Montagu，MV and Depicker，A.（1990）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1701747“target =”_ blank“>来自烟草的截短的T-DNA插入片段的克隆和序列分析。（基因）94（2）：155-63。

Lei，EP，Krebber，H.和Silver，PA（2001）。信使RNA在转录过程中被招募用于核出口。 Genes Dev 15（14）：1771-1782。

Sun，X.，Hu，Z.，Chen，R.，Jiang，Q.，Song，G.，Zhang，H. and Xi，Y.（2015）。＆nbsp; 使用CRISPR-Cas9系统的大豆中的靶向诱变。 5：10342。

Tang，X.，Zheng，X.，Qi，Y.，Zhang，D.，Cheng，Y.，Tang，A.，Voytas，DF and Zhang，Y。（2016）。＆lt; a class = -insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27212389“target =”_ blank“>用于在植物中有效进行基因组编辑的单一记录CRISPR-Cas9系统。 > Mol Plant 9（7）：1088-1091。