材料和试剂

移液器提示
1.5 ml微量离心管
用于蛋白酶体活性测量的黑色的96孔板（Corning，目录号：3603）
清除96孔板进行蛋白质测量（Greiner Bio One International，目录号：655101）
植物材料（该方案针对本发明的烟草样本，辣椒和/或拟南芥进行优化，但也可应用于其他植物物种或组织）
Murashige和Skoog（MS）琼脂（Sigma-Aldrich）
蔗糖（MP Biomedicals，目录号：04821713）
液氮（N 2 2）
Bio-Rad蛋白测定试剂盒II（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000002）
蛋白酶体底物
Suc-LLVY-AMC（胰凝乳蛋白酶样活性底物）（Sigma-Aldrich，目录号：S6510）
注意：蛋白酶体的其他蛋白水解活性可以使用相同的方案通过使用适当的底物（Z-ARR-AMC测量胰蛋白酶样活性[Bachem，目录号：I-1125.0050]和Z-LLE-用于测定20S蛋白酶体的肽基谷氨酰肽水解[PGPH]活性的AMC [Bachem，目录号：I-1945.0005]）。/ / em>
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A3377）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：60377）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15508013）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
蛋白酶体底物溶液（参见食谱）
提取缓冲液（见配方）
蛋白酶体裂解/测定缓冲液（参见食谱）

设备

移液器
pH计
软木钻孔直径0.7厘米（Sigma-Aldrich，目录号：Z165220）
顶置式搅拌器（Heidolph Instruments，型号：RZR 1）
冷冻微量离心机（4℃）
96孔板的可调节热块（Eppendorf，型号：ThermoMixer C）
读板器分光光度计（吸光度，荧光）（例如，BioTek Instruments，型号：Synergy HT）

软件

Gen5软件（Biotek Instruments）

程序

植物栽培
1. 拟南芥拟南芥种子（Ecotype Columbia-0）播种在补充有2％（w / v）的藻酸盐的Murashige和Skoog（MS）琼脂（Sigma-Aldrich）蔗糖，并在组织培养物中在70％湿度下在16小时光/ 8小时黑暗的条件（150μEm -2至 sec 的辐照度）下培养。。在土壤上发芽的种子在短时间条件下生长（8小时的光/ 16小时的黑暗[23℃/ 21℃]，150微米/平方米的辐照度< / sup> sec -1 ，70％湿度）
2. 烟草烟草和辣椒植物在日常浇水的温室中在土壤中生长并进行16小时光照/ 8小时黑夜循环（25℃） / 21℃），在300μEm sec -1 光和40％相对湿度。
样品制备
1. 用一个软木钻孔机（直径为0.7厘米）打出两到四片叶盘，将同一样品的圆盘与单个1.5毫升的微量离心管混合，立即在液氮中冷冻叶盘。样品可以储存在-80°C直到进一步处理。
2. 在顶置式搅拌器中研磨200μl提取缓冲液（参见食谱）中的冷冻叶子材料，直到材料完全解冻（确保防止样品加热）。或者，叶片可以在预冷的研钵中研磨成细粉末。加入提取缓冲液，继续研磨，直到材料完全解冻。将悬浮液倒入微量离心管中
3. 在4℃下以17,000×g离心样品10分钟，然后将上清液转移到新管中。
4. 使用Bio-Rad Assay Dye根据制造商的说明书使用BSA作为标准确定提取物的蛋白质含量。
5. 用提取缓冲液调节上清液的蛋白质浓度为1 mg / ml。将样品保存在冰上直至使用。尽快进行测量。通常不推荐将样品储存较长时间，因为蛋白酶体活性相对不稳定，即使储存在-80°C。
化验
1. 准备测定缓冲液（参见食谱）。
2. 将25-50μg植物提取物加入到黑色的96孔板的孔中，随后与220μl测定缓冲液混合。使用的提取物的数量是植物物种和组织依赖性，但应在单个实验中保持相同。经验地，来自烟草烟草或辣椒辣椒的50μg和来自拟南芥叶片样品的25μg的效果最好。每个样品/实验条件（即从接受相同处理的不同植物收获的材料）至少进行三次生物重复。
3. 在30°C孵育15分钟。
4. 将蛋白酶体底物加入孔（15-30μl/每个样品;最终浓度应为100μM至200μM）。添加至少三个空白孔，包括蛋白质提取物以外的所有溶液，以进行背景减除
5. 在120分钟的时间内，每隔1.5分钟在荧光板读数器上测量30℃下氨基甲基香豆素的释放（A 360°/ A / 460mm）。 br /> Gen5（Biotek Instruments）的协议细节如下：
  板型：96孔板
  设定温度：设定值30°C，预热，然后再转到下一步骤
  启动Kinetic：运行时间2:00:00（HH：MM：SS），间隔0:01:30，81读取
  阅读：荧光端点，全板，过滤器组1：激发：360/40，发射：460/40，光学：顶部，增益：60，读取速度：正常，高度：1 mm
  End Kinetic

数据分析

通过从所有值中减去空白孔（含有蛋白质提取物以外的所有溶液）的RFU水平，可以在相对荧光单位（RFU）中进行结果的表示。从发射曲线的平均线性斜率计算蛋白酶体活性（图1），并将其表示为每分钟荧光单位（RFU min -1 ）或相对于对照的百分数。平均斜率（Gen5中的平均V）通过软件通过计算区域（图1中的绿色条标示）上的点的线性回归计算。在Gen5（Biotek Instruments）中，转到Protocols＆gt;数据缩减＆gt;井分析和平均V箱。对于平均值V，计算区域通常会自动调整，以忽略由于噪声在动力学测定开始时产生的误导性数据点。然后可以在"统计"视图中按"编辑表"按钮将平均值V导出到Excel，以进一步分析（平均值和统计的计算）。有关仪器的具体细节，请参阅读板器的用户手册。
数据分析的典型结果如图2所示。在这里，作为对照，将胡椒植物与不同的细菌菌株和MgCl 2一起感染。对于实验，使用来自不同植物（至少n = 3能够执行统计学）的这种对照和叶材料是相同年龄的重要的。

图1.使用上述方法从拟南芥的叶样品中的蛋白酶体活性测量的典型输出的屏幕截图。在Biotek Synergy HT板上测量样品读者由Gen5软件（Biotek Instruments）控制。绿色条表示用于计算每分钟相对荧光单位（RFU min -1 ）的线性斜率部分。

图2. XopJ在黄单胞菌属 -pepper相互作用期间减少蛋白酶体活性。使用图中所示的野生型Xanthomonas campestris （Xcv）菌株渗透胡椒叶（WT，野生型;ΔxopJ ，缺乏缺乏III型效应子蛋白XopD的III型效应子蛋白XopJ;ΔxopD菌株的菌株）。通过在荧光分光光度计中监测荧光肽suc-LLVY-NH-AMC的分解来测定总叶提取物中的3dpi蛋白酶体活性。数据表示平均SD（n = 5）。使用Student's 测试计算出显着差异，并用以下表示：* 0.05; ** 0.01。

食谱

蛋白酶体底物溶液
将Suc-LLVY-AMC在DMSO中溶解至终浓度为2mM，并在-20℃下冷冻（稳定数月）
提取缓冲液（始终准备新鲜并保持在冰上直到使用）
2 mM ATP
50 mM HEPES-KOH（用1N KOH调节至pH 7.2）
2 mM DTT
0.25 M蔗糖
蛋白酶体裂解/测定缓冲液（始终准备新鲜并保持在冰上直到使用）
100mM HEPES-KOH（用1N KOH调节至pH 7.8）
5mM MgCl 2
10 mM KCl
2 mM ATP

致谢

这项工作得到了欧洲生物化学学会联合会（与S.Ü.的长期研究金）以及德意志丰业集团（授权号CRC973和BO1916 / 5-2至F.B.）的支持。该协议从Reinheckel等人描述的以前的工作中进行了修改。（2000）。

参考

Reinheckel，T.，Ullrich，O.，Sitte，N。和Grune，T。（2000）。氧化应激期间人造血K562细胞中20S和26S蛋白酶体活性的差异性损伤。 Arch Biochem Biophys 377（1）：65-68 。
Üstün，S.，Bartetzko，V.和Börnke，F。（2013）。＆nbsp; III型Xanthomonas campestris III型效应物XopJ靶向宿主细胞蛋白酶体以抑制水杨酸介导的植物防御。 PLoS Pathog 9（6 ）：e1003427。
Üstün，S.和Börnke，F.（2015）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25739698"target ="_ blank" > Xanthomonas campestris III型效应物XopJ蛋白水解降解蛋白酶体亚基RPT6。植物生理学168（1）：107-119。
Üstün，S.，König，P.，Guttman，DS andBörnke，F。（2014）。＆nbsp; 来自丁香假单胞菌的HopZ4，抑制植物中的蛋白酶体。植物微生物相互作用 27（7）：611-623。
Üstün，S.，Sheikh，A.，Gimenez-Ibanez，S.，Jones，A.，Ntoukakis，V.andBörnke，F。（2016）。＆nbsp; 蛋白酶体作为植物免疫的中枢，是由三态效应子假单胞菌靶向的。植物生理学 172（3）：1941-1958。