材料和试剂

应分析的应变
待分析菌株的过夜培养物和亲本对照
葡萄糖
MOPS
酵母提取物
细菌蛋白胨
酵母氮基
媒体
1. RPMI培养基1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：31800-089）（参见Recipes）
  注意：这是CLSI标准协议推荐的标准介质。
2. YPD（见配方）
  注意：这是一种通常用于评估不同突变体易感性的丰富介质。
3. 合成定义介质（参见配方）
  注意：添加所需的氨基酸以使营养缺陷型菌株生长通常用于需要质粒选择的实验。

设备

96孔组织培养板（带盖的平底）（SARSTEDT AG，目录号：83.1835）
酶标仪
多通道移液器[可选：多通道电子移液器（Rainin，型号：EDP3-Plus）]

软件

Soft Max Pro或同等分光光度计软件（Microplate Data Processing）
Microsoft Excel（数据分析）
JavaTree视图（热图生成， http://jtreeview.sourceforge.net/）

程序

在3ml待测试的合适培养基中生长待测试菌株的过夜培养物，包括相关对照。
用要测试的药物梯度制备MIC板。
1. 总是设置一式两份。
2. 使用多通道移液器添加100微升培养基到所有96孔除了第12列。
3. 到第12列，加入200微升含有药物的培养基，其浓度为滴定起始浓度的2倍。
4. 通过将100μl含药物培养基从柱12转移到柱11进行2倍稀释（混匀并重复横行）。停止在第2列，丢弃多余的100μl，使第1列是无药物对照
在96孔板中一式两份测量100μl过夜培养物的OD 600。
1. 从仅培养基孔中减去OD <600>读数以计算背景。
2. 计算每个菌株的平均OD 600。
为了在5ml培养基中制备接种物，加入1/OD600μL×1.5μl过夜培养物。
从列1至12的每个孔中加入100μl稀释的接种物（〜10μL/孔细胞），每行一个菌株。
在合适的温度（35℃是CLSI标准批准的标准温度，37℃是临床相关温度，30℃是通常使用的实验室温度）下，在所需的时间内静止培养板，通常为 24，48或72小时。
为了准备用于OD 600读数的板，用多通道移液器混合孔。
在Excel中处理数据。
1. 将每个药物复制的OD ₆₀₀值复制到新工作表中。
2. 在第一行值的上方，标记每个柱的具有适当浓度的药物梯度。
3. 标记最左列中的菌株。
4. 计算中等值的平均值，并从板上的所有值中减去。将任何负数转换为"0"。
5. 计算每个重复值的平均值。
6. 任选：为了使药物梯度相对于其无药物对照的生长正常化，将每个孔的OD 600值除以柱中孔的OD 600值 1。
7. 使用"粘贴特殊"将参考值复制到新工作表，选择"仅值"，并按以下格式排列。
  
  注意：此数据由作者于2015年10月15日更新。
8. 另存为文本（制表符分隔）文件。
在JavaTree视图中将数据绘制为热图。
1. 在JavaTree View.a中打开文本（制表符分隔）文件。
2. 在设置下，对像素进行以下更改。
  
  缩放X：固定缩放= 60
  缩放Y：固定比例= 60
  对比值：1
  正：102，204，0（绿色）
3. 导出文件
  
  上图从参考文献2改编，并且基于与上面的点8g相关联的表格中所示的数据绘制。通过光密度测量的生长用颜色条定义地显示颜色，使得亮绿色表示完全生长，黑色表示无生长。如上所述，每个菌株的生长可以绘制为相对于相同菌株标准化为无药物对照的值，或者可以直接绘制生长而不进行归一化。

食谱

RPMI培养基1640（pH7.0） 3.5％MOPS
2％葡萄糖
YPD
1％酵母提取物
2％细菌用蛋白胨 2％葡萄糖
合成定义的介质
0.67％酵母氮碱
2％葡萄糖

致谢

该方案中报道的方法基于Singh-Babak等人（2012）中描述的方法。 JLX由安大略研究生奖学金，多伦多大学开放研究金和加拿大卫生研究院（CIHR）Frederick Banting& Charles最佳CGS博士奖，SDSB由CIHR Frederick Banting& Charles Best CGS博士学位奖，LEC荣获由Burroughs Wellcome基金颁发的生物医学科学奖，由加拿大微生物基因组学和传染病研究主席，研究与创新部早期研究员奖，以及NSERC发现奖355965-2009。

参考文献

临床和实验室标准研究所（CLSI）。酵母的肉汤稀释抗真菌敏感性试验的参考方法;批准的标准 - 第三版。 CLSI文件M27-A3（ISBN 1-56238-666-2）。临床和实验室标准研究所，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2008.
Singh-Babak，S.D.，Babak，T.，Diezmann，S.，Hill，J.A.，Xie，J.L.，Chen，Y.L.，Poutanen，S.M.，Rennie，R.P.，Heitman，J.and Cowen，光滑念珠菌中Echinocandin抗性的进化和机制的全球分析。 PLoS Pathog 8（5）：e1002718。