材料和试剂

Eppendorf管
10厘米直径的Petri板
96孔板或ELISA板（Thermo Fisher Scientifc，Thermo Scientifc TM，目录号：442404）或比色皿（Sigma-Aldrich，目录号：Z276758）
在应激期间收集叶或根组织（约10片或250毫克）
蒸馏水
埃文蓝（Sigma-Aldrich，目录号：E2129）
氯化钠（NaCl）
硝酸钾（KNO 3 ）
硝酸钙四水合物，Ca（NO 3 3）2·4H 2 O - / -
磷酸二氢铵（NH 4 H 2 PO 4）＆lt;
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）
氯化钾（KCl）
硼酸（H 3 3 BO 3）
硫酸锰（MnSO 4·H 2 O）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）
钼酸（H 2 O 3 MoO 4）
Na·Fe·DTPA
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
盐酸（HCl）
Evan的蓝色染色溶液（参见配方1）
Hoagland解决方案（请参阅配方2）
pH值为5.6的0.1M CaCl 2（参见方法3）
1％SDS（参见配方4）

设备

移液器
（可选）杵和砂浆
组织裂解器（组织溶解酶II）（QIAGEN，目录号：69982）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM ST16，目录号：75004240）
光学显微镜（MAGNUS ANALYTICS，型号：MLX）
pH计（Systronics，型号：μControllerBased pH系统361，目录号：361）
分光光度计/ ELISA读板仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax Plus 384）
轨道摇床（Shalom Instruments，型号：SLM-GR-100）

程序

准备Evan的蓝色解决方案（请参阅配方1）
用Evan的蓝色染色组织以评估膜稳定性的程度

在正常条件下种植植物。
施加应力处理以确定植物的特定生长阶段并收集组织（叶或根）。
例如，我们强调从30天的花生植物收集的叶子。我们用1厘米直径的小叶盘进行叶盘测定。我们将10片叶片转移到培养皿中，然后施加甲基紫精（MV）诱导的氧化应激治疗。 5μM的甲基紫精暴露于一组（应力），另一组保存在纯水（对照）中，这些叶盘暴露于高光条件下（1000μmol/平方米） -1 ）室温（RT）3小时。然后将这些叶片用Evan的蓝色染色剂染色（图1A）
在另一组实验中，NaCl（150mg，在Hoagland溶液中[参见方法2]）对一组水稻幼苗（胁迫）施加压力，另一组在水培实验（Lopez）中仅保留在Hoagland's溶液（对照）中和Satti，1996）。压力强制三天后，从控制和应激植物收集根部，进行Evan蓝染色和膜稳定性测定（图1B）。该方法具有高达95％精度的高度可重现性
将收集的叶和根组织转移到2ml Eppendorf管中，并向每个管中加入2ml Evan's蓝色溶液。
注意：调整音量以确保纸巾浸入溶液中。

图1.使用Evan的蓝色染色测定膜稳定性。（A）甲基紫精（MV）5μM处理的叶片和（B）150mM NaCl处理的根中的Evan蓝染色的显微镜检测。比例尺表示25μm。将来自30日龄植物的花生叶片在高光强度为1,000μmol/平方米以上的温度下温育3小时，随后叶片被Evan的蓝色染料染色。对于NaCl胁迫，将30天龄的水稻幼苗暴露于150mM NaCl 3天，并用Evan蓝染料染色以评估膜完整性。
以50振荡/分钟振荡振荡器振荡管20分钟注意：抖动只是为了确保所有的组织都与Evan的蓝色染料溶液接触。
用蒸馏水彻底清洗根和叶子三次，或直到未结合的染料从表面洗出来注意：（可选）根或叶组织也可以用pH 5.6的0.1 M CaCl 2 洗涤（参见配方3）
在正常透射光学显微镜下观察染色的叶或根。检查叶子或根，并在明场显微镜下拍摄图像。此外，Evan的蓝色染色图像可以使用imageJ软件进行量化，以评估细胞的活力。
注意：如果样本量很大，最好只进行分光光度定量，并且可以应用适当的统计数据来达到显着性水平。

量化Evan由于膜不稳定而吸收的蓝色污点

从根部和叶子中提取Evan的蓝色染料，使用1ml 1％SDS（见配方4）细胞裂解缓冲液，其分解膜结构。
如果样本数量大，则使用每秒15次的组织淋巴细胞研磨100mg组织10分钟。如果只需要几个样品，就可以在杵和砂浆中研磨。研磨后，将提取物转移到2ml Eppendorf管中。
在室温下将提取物以7,168 x g离心5分钟，将染料洗脱至溶液中并除去碎屑。
将上清液转移到新管中或直接将250μl上清转移到96孔微量滴定板上。
注意：由于Evan的蓝色染料不会氧化，因此可以在室温下储存半小时以测量大样品。
通过使用1％SDS作为空白，使用比色皿或平板读数器在600nm下以分光光度法测量光密度。
Evan蓝色的浓度可以通过参考标准曲线来估计（图2）
绘制Evan蓝色浓度的图表，y轴和植物数量或x轴上的应力处理（图3A和3B）。

图2. Evan蓝染色的标准图。标准图是使用伊万蓝色储备溶液1μgml-sup。稀释不同浓度的埃文蓝，600nm处记录吸光度

图3.使用分光光度法测定膜稳定性。直方图显示了（A）叶组织和（B）根组织吸收的Evan蓝色染料的程度，作为膜损伤的反映。通过在1％十二烷基硫酸钠（SDS）中研磨组织并测量600nm处的吸光度并使用标准曲线图计算细胞吸收的染料的程度。错误栏表示三个重复数据的最小值。 *表示P 下的最小显着差异（LSD） 0.05使用GenStat统计工具分析。

使用Evan的蓝色准备标准曲线：
将1μgEvan's蓝色溶解在1ml蒸馏水中，得到1μg/ ml的原液。从储备溶液中制成5个浓度，使体积达到1毫升。在分光光度计中在600nm处测量吸光度（图2）。

数据分析

使用至少三种生物重复来定量Evan蓝染料的摄取，并使用GenStat程序（Marcos等人，2013）分析数据。根据基因型和治疗水平的数量，使用方差分析（ANOVA）测试显着性水平。

食谱

Evan的蓝色染色溶液
将0.25g Evan's蓝色染料溶解于100ml pH 0.1的0.1M CaCl 2溶液中，并充分混合，直至溶解。注意：Evan的蓝色解决方案应该每次新鲜准备。
Hoagland解决方案
本实验中使用的Hoagland溶液的组成在表1中给出。

表1. Hoagland解决方案的组成

*注意：在盐胁迫治疗中应避免这种情况。
0.1M CaCl 2 pH5.6的比例为了制备0.1M CaCl 2，将1.10g CaCl 2（分子量= 110.989）溶于蒸馏水（1L）中，并用0.2N HCl将pH调节至5.6。 CaCl 2 2溶液可以在RT
中储存一个月
1％SDS
为了制备1％SDS，加入1g十二烷基硫酸钠至80ml蒸馏水中，并将其体积至100ml。使用前应先将SDS准备好。可选地，它可以在RT
中存储一个月

致谢

印度农业研究理事会 - 利基卓越地区计划（F.10-（6）/ 2005 EPD）和（F. No. 10（15）2012 EPD）。 MUK承认支持印度NASI的铂金禧年奖学金。

参考

Baker，CJ和Mock，NM（1994）。改进的方法用于监测细胞悬浮液中的细胞死亡和使用Evan's蓝色的叶片测定。植物细胞组织器官培养 39（1）：7-12。
Gaff，DF和Okong'O-Ogola，O.（1971）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https://academic.oup.com/jxb/article-abstract/22/3/ 756/575449 /用于测试的非渗透颜料 - 重定向的FANG = PDF“target =”_ blank“>使用非渗透色素测试细胞的存活。 J Exp Bot 22：756-758。
Lopez，MV和Satti，SME（1996）。 Calcium和氯化钠胁迫下番茄钾增加和产量。植物科学114：19-27。
Marcos，M.，Jean-Marcel，R.和Fred，AV（2013）。多环境数据的统计分析：建模基因型与环境的相互作用及其遗传基础。前生理学4：44.

Oprisko，MJ，Green，RL，Beard，JB和Gates，CE（1990）。在12个温暖季节多年生草中的根毛的重要染色。作物科学 30：947-950。

Vemanna，RS，Babitha，KC，Solanki，JK，Amarnatha Reddy，V.，Sarangi，SK和Udayakumar，M.（2017）。 Aldo-keto还原酶-1（AKR1）通过解毒反应性细胞毒性化合物来保护细胞酶免受盐胁迫。植物生理生化< / em> 113：177-186。

Smith，BA，Reider，ML和Fletcher，JS（1982）。植物组织培养物衰老期间生物染色与传代培养生长之间的关系植物生理学70：1228-1230。

Sullivan，CY和Ross，WM（1979）。选择谷物高粱中的耐旱和耐热性在：Mussell，H.和Staples，RC （编辑）。作物植物应激生理学。 John Wiley and Sons pp：263-281。