材料和试剂

MultiGuard屏障移液管提示1-20和1-200μl（Sorenson BioScience，目录号：30550T）
Nunc TM细胞培养处理的多片剂（6孔）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：140675）
微量离心管安全锁写入刻度与盖子闩1.5毫升
无菌注射器（10 ml），通用型
Millex-HA 0.45μm过滤器（默克，目录号：SLHAM33SS）
96孔白板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：136101）
HEK 293T / 17细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）
Huh7细胞（Cell Signaling Technology，目录号：300156）
质粒
1. 糖蛋白表达质粒：pCAGGS-SARS-CoV spike
2. 表达萤火虫萤光素酶的慢病毒载体：pCSFLW
3. 第二代慢病毒包装构建质粒：p8.91（表达gag，pol和rev）
注意：有关上述质粒的信息可以在Temperton等人（2005）和Carnell等人（2015年）。肯特大学病毒假单位的质粒。 n.temperton@kent.ac.uk
补充有10％胎牛血清（FBS）（Pan-Biotech，目录号：P40-37500）和1％青霉素/链霉素（P / P）的具有GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，目录号：31966021）的Dulbecco改良Eagle培养基S）（Pan Biotech，目录号：P06-07100）
Gibco减少血清培养基Opti-MEM ®（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985047）
分散聚乙烯亚胺（PEI）溶液，浓度为1mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：408727）。
注意：将PEI溶解于浓度为1mg / ml的dH （1：3）浓HCl。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），苯酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：25300054）
可以中和SARS假型的阳性对照抗体（单克隆/多克隆或后感染血清）
Bright Glo TM 荧光素酶测定系统（Promega，目录号：E2650）

设备

II类生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：MSC-Advantage TM ）
水浴或孵化器
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN Classic，P2，P20，P200和P1000）
可选：BIO-RAD TC20 TM 自动细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450102EDU）
板式离心机（ELMI，型号：SkyLine CM-6MT）
Glomax 96光度计（Promega，型号：GloMax 96）
注意：本产品已停产。

程序

转染步骤
注意：所有步骤都应在II类生物安全柜内进行，以避免污染。时间表：转染-24小时
1. 293T / 17细胞应以转染时可提供70-90％汇合的比例传代培养至6孔板中。通常每孔接种4×10 5个细胞将达到这种融合水平。示例如图2所示
  
  图2. HEK293T / 17细胞转染前预期的融合实例
时间表：转染日。
1. 应使用水浴或孵化器将DMEM / 10％FBS / 1％P / S和Opti-MEM ®预热至37°C。
2. 为将用于转染的6孔板的每个孔准备两个标记为无菌的1.5ml微量离心管（管1和管2）。
3. 将以下用于转染的质粒构建体添加到管1：
  pCAGGS-SARS-CoV峰值：450ng
  p8.91-慢病毒载体：500ng
  pCSFLW：750 ng
4. 向质粒DNA混合物（管1）中加入100μlOpti-MEM ®
5. 向管2中加入100μlOpti-MEM 和17.5μl1mg / ml PEI。
6. 孵育步骤：通过轻轻摇动混合两个管，并在室温（RT）下孵育5分钟
7. 孵育后，将管2中的Opti-MEM / PEI溶液移至管1中的Opti-MEM ® / DNA溶液。
8. 孵育步骤：在室温下孵育管20分钟，同时轻轻地将管子每3-4分钟混匀。
9. 转染混合物孵化时，应去除293T / 17细胞上的培养基，每孔加入2ml新鲜的DMEM / 10％FBS / 1％P / S。在这一点上，必须缓慢地将培养基添加到井的一侧，以避免分离贴壁细胞单层。
10. 孵育20分钟后，将DNA / Opti-MEM / PEI溶液移液至293T / 17细胞上，逐滴加入孔的整个表面积。轻轻旋转6孔板，以确保均匀分散的试剂混合物。
11. 孵育步骤：将板在37℃，5％CO 2孵育过夜（o / n）。在我们手中，在12-16小时之间的孵化时间会导致相当的最终光伏产量RLU滴定度。
时间轴：转染后12-16小时。
1. 培养后培养细胞应小心取出，加入2ml新鲜的DMEM / 10％FBS / 1％P / S。再次将介质慢慢地添加到井的一侧，以避免细胞脱离
2. 将6孔板在37℃孵育5％CO 2 / o / n 32-36小时。
时间表：转染后44-52小时。
1. 使用2.5ml无菌注射器收集含有病毒假型颗粒的上清液，随后通过注射器驱动的Millex HA-0.45μm过滤器过滤入Falcon或微量离心管。
2. 将所有过滤的上清液储存在-80°C直到下游使用。建议将上清液等分储存，以避免可能影响病毒RLU滴度的多次冻融循环。
  注意：上清液可以在4℃下储存长达一周，没有可检测到的RLU滴度的损失。
3. 任选步骤：另外的培养基可以添加到细胞中，以允许第二次收获18-24小时后，再加入DMEM / 10％FBS / 1％P / S。在这种情况下，在初始PV收集中必须格外小心（步骤A15），以避免损伤细胞单层。我们已经观察到，第一次收获后的健康状况不佳的细胞在第二次收获后导致PV生产的RLU滴度显着降低
注意：可以通过遵循上述步骤创建控制假型病毒，但省略pCAGGS-SARS-CoV尖峰构建体。这产生不表达病毒表面糖蛋白的颗粒（Delta Env对照，图3）。

滴定步骤（图3）
注意：滴定由报告人（在这种情况下是萤火虫萤光素酶）转导到由病毒假型（SARS-CoV尖峰）上表达的病毒糖蛋白介导的靶细胞中。用于滴定的控制是通过包含“仅细胞”和“Delta Env”列提供的。可以通过带有Vesicular口腔炎病毒G蛋白（VSV-G）的PV提供转导控制，该蛋白利用普遍存在的受体，在测试的所有细胞系中导致高RLU滴度。

图3.用于假型滴定的96孔板装置串行稀释步骤显示向A列的每个孔中加入100μl假型病毒上清液，并从该孔中取出50μl的稀释液B.该过程继续到板（行H）的终点，此时最后的50μl被丢弃。 Delta Env控件用红色表示（第11列），单元格控件用绿色表示（第12列）。每个稀释系列（板）可以使用一套移液器吸头。
1. 在96孔白板中，在“单元”对照的整列中加入50μl的DMEM / 10％FBS / 1％P / S（参见图3第12列）。
2. 将50μlDMEM / 10％FBS / 1％P / S从B行添加到H，其中包含PV或Delta-Env对照病毒。
3. 向A列（不包括对照色谱柱）的每个孔中加入100μlSARS假型病毒上清液，并加入100μlDelta-Env至第11列（见图3）。
4. 从行A病毒的孔中取出50μl，并对其下面的所有孔进行两次连续稀释。
5. 每个稀释步骤使用移液管混合8次，上下移动，注意不要产生气泡。
6. 完成连续稀释后，应从每列最后一个孔中取出最终的50μl 注意：此时每个孔都应含有50μl混合的DMEM和PV上清液。
7. 准备一片敏感靶细胞（Huh-7为SARS PV），优先传播1：4 48 h之前：
8. 离心板在800 x g（Rcf）下放置1分钟，如果孔两侧有可见的液滴。
9. 在37℃5％CO 2 孵育板48小时。
10. 在Glomax 96光度计（或等同物）上使用Bright Glo TM 荧光素酶测定系统读板。
基于假型的中和测定（pMN）
注意：pMN是通过针对SARS糖蛋白的抗体（或抑制剂）抑制PV介导的转导。
1. 在96孔白板中，向B列至H列1-12列加入50μlDMEM / 10％FBS / 1％P / S。
2. 在100μlDMEM / 10％FBS / 1％P / S的总体积中，将已知量的抗体（例如图4中的5μlHN和R血清）加入到A列，2-10栏的孔中。向井A11和A12作为对照，加入已知量（例如，5μl）的阳性和阴性抗血清。
  
  图4.抗SARS抗体（感染后血清HN和R）中和SARS病毒假型进入Huh7细胞每个血清样品绘制两个重复。
3. 从A排孔中取出50μl，并在其下面的所有孔上进行两次连续稀释。
4. 每个稀释步骤，使用移液管，通过上下移动进行15次混合，注意不要产生气泡。
5. 完成连续稀释后，应从每列最后一个孔中取出最终的50μl 注意：此时每个孔都应含有50μl混合的DMEM和连续稀释的抗体/抑制剂。
6. 离心板在800 x g（Rcf）下1分钟，以确保在井壁上没有抑制剂或液体。
7. 使用从滴定获得的数据，计算稀释您的SARS-PV所需的DMEM的量，以获得50μl中的1×10 6个/ uLU，总体积为5ml。例如，使用1×10 8 L / L的RLU / ml，应将1ml的PV与4ml的DMEM混合。
8. 使用多通道移液管将此稀释的PV溶液混合，并将平板等分至每孔中，除了孔A6-A12（仅细胞控制）外。 A1-A6将仅用作病毒控制
9. 离心板在800 x g（Rcf）1分钟，以确保没有病毒留在井壁上。
10. 在37℃5％CO 2孵育板1小时，允许抗体/抑制剂结合SARS糖蛋白的时间。
11. 准备一片敏感靶细胞（Huh-7为SARS PV），优先传播1：4 48 h之前：
12. 在37℃5％CO 2 孵育板48小时。
13. 在Glomax 96光度计（或等同物）上使用Bright Glo TM 荧光素酶测定系统读板。

数据分析

RLU读数通过每个孔的稀释因子（20x，40x，80x，160x，320x，640x，1,280x，2,560x）乘以RLU / ml。所有8 RLU / ml值的平均值用作滴定步骤中该柱所报告的最终值。在RLU值和PV稀释之间应该观察到线性关系，每稀释1：2后，值降低50％。在乘法之前应注意检查这种线性关系，因为尽管缺乏光伏或工作光伏，但这固有的可能导致误报（表1）。

表1. PV滴定数据分析 RLU值乘以RLU / ml值（以绿色突出显示），给出每个稀释点的RLU / ml值。然后从所有8个稀释点计算平均值/平均值。必须注意观察稀释因子（X因子）和RLU之间的线性关系，或乘法可导致RLU / ml膨胀的值（例如黄色突出显示）。
方案读取和滴定结果（图5）

图5.使用优化转染方案的假型产生RLU滴度的结果 SARS;具有SARS-CoV的PV表面上的尖峰，细胞;单元控制，三角洲环境;无表面糖蛋白，VSV-G;表面具有VSV-G的PV。
概述的方案提供了用于产生表达适合进一步下游R＆amp; D应用的SARS-CoV尖峰蛋白的高滴度病毒假型颗粒的快速且一致的方法。使用两种感染后血清（HN和R）对SARS-CoV假型病毒进行有效击倒（中和）显示了疫苗免疫原性和mAb /抗病毒筛选的潜在效用。使用容易获得的试剂应有助于提高再现性。

致谢

作者承认陈博士（香港中文大学医学院）两位阳性感染后控制血清。这项工作由Medway药学院，英国肯特资助。该协议由PMID修改和改进：15757556和26587388。

参考

Carnell，GW，Ferrara，F.，Grehan，K.，Thompson，CP and Temperton，NJ（2015）。用于流感的基于假型的中和测定：系统分析。免疫组织 6：161.

Grehan，K.，Ferrara，F.and Temperton，N。（2015）。用于产生MERS-CoV峰表达病毒假型的优化方法。方法X 13（2）：379-384。

Temperton，NJ（2009）。＆nbsp; 使用逆转录病毒假型测定SARS冠状病毒的抗体应答。在Lal，SK（Ed。）。 SARS冠状病毒的分子生物学。 Springer 。

Temperton，NJ，Chan，PK，Simmons，G.，Zambon，MC，Tedder，RS，Takeuchi，Y.and Weiss，RA（2005）。纵向表征中和抗体对SARS冠状病毒的假型的反应。 11（3）：411-416。

Temperton，NJ，Wright，E.and Scott，SD（2015）。逆转录病毒假型 - 从科学工具到临床实用。 eLS 1-11。