设备

可上网的电脑或笔记本电脑
注意：它应该适用于所有常见的操作系统。但是，某些限制可能适用于特定的操作系统。对于标准分析，任何现代硬件设置（台式机或笔记本电脑）都应该适合于相当快的结果。

软件

要使用此协议中提供的脚本，必须至少安装以下软件包之一：

Microsoft Excel或R
电子表格，如Microsoft Excel，F＃（ https://fsharp.org/ ），包含库FSharp.Plotly和Fsharp .Stats或R（ www.r-project.org ）及其包装seqinr，signal和Biostrings （Pagès et al。，2018）。
TargetP 1.1 Server或TargetP包
TargetP算法（Emanuelsson et al。，2007）可以通过TargetP 1.1 Server的接口使用（ http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ ）。或者，可以下载TargetP软件包并离线使用。请参阅此处所述的说明： http://www.cbs.dtu.dk/服务/ TargetP / instructions.php 。对于本协议中说明的过程，在线版本已足够，不需要安装独立软件包。然而，这个独立的软件包提供了评估大型数据集（例如全基因组分析）的可能性，这对于在线服务几乎是不可能的。

程序

从给定的蛋白质序列产生TargetP谱。
对于您提交的每个蛋白质序列，TargetP将仅给出一个值，指示序列的N末端是否看起来像MTS。为了分析蛋白质的完整长度，您必须在N末端之后重复截短一个残基的序列，并将所有这些序列提交给TargetP。我们描述了如何有效地完成这两项工作的方法：一方面，我们详细说明如何使用标准电子表格应用程序和在线转换工具生成包含给定序列的所有截断的FASTA文件。另一方面，我们提供用 R和F＃可用于自动生成所需的FASTA文件。如果您希望分析大量序列例如，进行全基因组分析，后者尤其有用。

使用Microsoft Excel等电子表格软件
使用Microsoft Excel或其他常用电子表格软件，可以通过使用以下策略（图1A）简单地完成：
1. 在电子表格的第一列填写数字1,2,3，...
2. 将氨基酸序列复制并粘贴到电子表格的第一行第二列（单元格B1）。如果终止密码子用星号（*）表示，则从序列中删除它，使最后一个字符是有效的氨基酸。
3. 在第二行（单元格B2）中，使用以下命令生成截断序列：= MID（B1; 2; LEN（B1）-1）
  这将从B1创建一个子字符串，其中一个字母小于B1，从字符编号2开始。请注意，在不同版本的Excel中（特别是在使用不同的语言设置时）和其他电子表格软件时，命令的关键字和语法可能是稍微不一样。
4. 单击单元格B2的右下角并向下拖动公式以重复将其应用于第二个，第三个...截断，直到最后一个残差保留在列的最后一个单元格中。
5. 突出显示单元格A1和A2并向下拖动（或双击）A2的右下角以填充第一列，其中数字1,2,3，...表示第二列中序列的起始位置。
6. 以“制表符分隔格式”保存此文件（文件扩展名通常为.tab或.txt）。
7. 将您生成的文件提交给文件转换工具（例如， HIV序列数据库格式转换器或 Bugaco序列转换）生成有效的FASTA文件。选择适当的选项，尤其是输入和输出格式（TAB和FASTA）。
8. 您收到的文件现在应该具有残差编号1,2,3，...作为顺序截断序列的FASTA标题。
  注意：
  1. 此文件现在可以在线提交给TargetP（ http：//www.cbs.dtu没有自动跳转/服务/ TargetP / ）。
  2. 输出将显示在浏览器中。将输出复制并粘贴到纯文本编辑器（不是Word，OpenOffice或类似文件！）中，并将其另存为.txt文件。
  3. 将文件导入电子表格应用程序。在Excel中，打开一个新的电子表格并选择“数据”，“从文本导入”。选择适当的选项以将不同的值导入不同的列。线粒体定位评分用“mTP”表示。
  4. 请注意，TargetP将输入的大小限制为当前2,000个序列，每个序列最多4,000个残基，总共200,000个残基。对于长度超过631个残基的蛋白质，违反了这些限制。如果您想分析含有更多残留物的蛋白质，请将FASTA文件分成不同序列的不同文件并单独提交。
图1.关于iMTS-L预测中不同步骤的概述。 A.使用电子表格软件（如Microsoft Excel）进行的iMTS-L预测。 B.用于生成具有截断序列的FASTA文件的步骤。

使用R
上述方法非常适合于生成各个目的蛋白质的谱。当应该分析更大的序列集时，以编程方式生成所需的FASTA文件更方便。在以下段落中，我们描述了如何使用编程语言R或F＃之一来实现这一点。要使用提供的R函数，需要库
seqinr ，
signal 和
Biostrings 来读写FASTA文件。要安装它们，请使用管理员权限运行R并在shell中键入以下命令：

来源（“ https://bioconductor.org/biocLite.R ”）
biocLite（“Biostrings”）
biocLite（“seqinr”）
biocLite（“信号”）

要生成FASTA文件，请截断以下步骤（图1B）：
1. 要在您自己的脚本中使用该功能，请使用：
  
  source（“path / to / the / file / truncateSeq.R”）
2. 将感兴趣的氨基酸序列加载到字符变量中。如果您将其存储为FASTA文件，则可以使用 Biostrings中的 readAAStringSet 函数 package，例如：
  
  fastaInput＆lt; - readAAStringSet（“input.fasta”）
  序列＆lt; - paste（fastaInput）
3. 如果您的fasta文件中有多个序列，这将创建所有序列的列表。
  paste命令用于从 readAAStringSet 创建的更复杂的对象中提取序列字符串。
4. 要生成包含所有截断的表并写入相应的FASTA文件，请使用：
  
  truncateSeq（sequence，write.fasta = TRUE，filename =“result.fasta”，split.fasta = 0）
  
  如果您不想编写FASTA文件但只在R会话中生成表，请设置write.table = FALSE。在这种情况下，所有其他参数都将被忽略。
  要自动将序列拆分为多个FASTA文件，每个文件包含n个序列，请设置split.fasta = n。对于长序列（超过631个残基），这可能是必需的。
5. 将FASTA文件提交给TargetP并按上述步骤进行操作。
  我们提供两个源文件。文件 truncateSeq.R 包含生成截断的函数序列。文件 exampleProfile.R 可用作模板使用上述程序。它还包含绘制和平滑轮廓的命令（参见程序B）。
  
  图2.使用F＃进行iMTS-L检测的工作流程概述。有关详细信息，请参阅文本。
使用F＃
F＃是一种现代强类型，跨平台编程语言，由于其功能优先的方法非常适合数据分析任务。 F＃Software Foundation提供了每个通用平台的开发环境以及如何入门的介绍（ https://fsharp.org < / A>）。以下记录的F＃代码（图2）指导了从给定氨基酸序列生成TargetP谱：
1. 加载外部函数以读取和写入FASTA文件。（相应地更改 * path * ）
  
  #load“* path * / BioFSharp.lite.IMTS_like.fsx”
  打开BioFSharp.lite.IMTS_like
2. 以fastA格式从提供的文件中读取感兴趣的氨基酸序列。（ * path / input.fastA * 需要用指向目标fastA文件的文件名和路径替换）
  
  FastA.fromFile id“* path / input.fastA *”
3. 生成给定氨基酸序列的所有后缀序列。
  
  |＆GT; Seq.collect（有趣的快速 - ＆gt; IMTSLs.generate fasta.Header fasta.Sequence）
4. 将所有后缀序列以fastA格式写入输出文件中。（更改 * path / output.fastA * ）
  
  |＆GT; FastA.write id“* path / output.fastA *”
5. 输出文件现在可以在线提交给TargetP。（ http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ ）。
6. 如上所述，将输出复制并粘贴到文本文件中。
方便分析将TargetP得分（mTP）与序列位置作图，以获得目标蛋白的TargetP谱（图3A）。内部峰值已经很好地可见，无需进一步处理。但是，为了更清楚地定义iMTS-Ls并对其进行定量分析，我们建议采用程序B中描述的平滑程序。为了实现F＃的完整图表容量，可以从Github或Nuget Package获得FSharp.Ploty库。对于后一种类型，请将“
dotnet add package FSharp.Stats ”加载到命令行中。

加载FSharp.Plotly库。（更改*路径* ）

#r“* path * / FSharp.Plotly.dll *”
打开FSharp.Plotly

从文本文件中读取TargetP分数。（更改 * path / targetP_out.txt * ）

让rawprofile = parseTargetP“* path / targetP_out.txt *”

生成一个面积图，显示序列位置与原始TargetP得分。

Chart.SplineArea（rawprofile |＆gt; Seq.mapi（fun i v - ＆gt; i，v））
|＆GT; Chart.withX_AxisStyle“氨基酸位置”
|＆GT; Chart.withY_AxisStyle“TargetP得分”
|＆GT; Chart.Show

源文件 BioFSharp.lite.IMTS_like.fsx 总结了所描述的过程，还包含平滑配置文件的命令（参见程序B）。
平滑TargetP配置文件以使iMTS-Ls更清晰可见
由于TargetP算法的原始设计，它在考虑固定窗口大小内的N端序列属性的情况下将得分计算为目标序列似然。因此，去除每个第一氨基酸残基并沿给定序列移动窗口导致可能性的波动。因此，我们建议平滑原始分数以允许定量测量并提高定位iMTS-Ls的准确度（图3B）。
虽然可以使用许多不同的方法进行平滑处理，但我们可以推荐一阶Savitzky-Golay滤波器（Savitzky和Golay，1964），滤波器长度为21（这是MTS的平均长度）。

图3.来自 S的模型蛋白Atp1的TargetP得分。 cerevisiae 作为例子。显示在（A）之前和平滑之后（B）的原始targetP配置文件。高TargetP值与iMTS-L序列相关，这两种情况在两种情况下均可见。

使用R
Savitzky-Golay过滤功能包含在R包信号中。
1. 加载信号包库（信号）。
2. 从输出文件中读取TargetP分数。
  
  data＆lt; - read.csv（“output.fasta”）
  
  您可能需要根据输出的确切格式指定 read.csv 命令的选项.fasta 文件（ sep ， dec ，标题等等）。
3. 应用Savitzky-Golay过滤。以下命令将带有平滑值的列添加到数据框中。
  
  data $ smoothed＆lt; - sgolayfilt（数据$ mTP，p = 1，n = 21，m = 0，ts = 0）
使用F＃
Savitzky-Golay过滤功能在Github提供的FSharp.Stats库中可用，或者作为Nuget Package（“
dotnet add package FSharp.Stats ”）。
1. 加载FSharp.Stats库。（更改 * path * ）
  
  #r“* path * / FSharp.Stats.dll *”
  打开FSharp.Stats
2. 使用Savitzky-Golay过滤平滑原始配置文件。
  
  let profile = rawprofile |＆gt; Signal.Filtering.savitzky_golay 21 1 0 0
3. 生成一个面积图，显示序列位置与TargetP配置文件得分。
  
  Chart.SplineArea（profile |＆gt; Seq.mapi（fun i v - ＆gt; i，v））
  |＆GT; Chart.withX_AxisStyle“氨基酸位置”
  |＆GT; Chart.withY_AxisStyle“TargetP个人资料得分”
  |＆GT; Chart.Show

数据分析

利用上述程序之一产生的谱可以容易地用于得出关于推定的iMTS-L序列的存在和位置的结论。应该注意的是，这些是通常应该通过实验解决的预测，例如通过改变所识别的延伸（Backes et al。，2018）。
为了比较较大的蛋白质组，iMTS-L谱可用于计算统计学测量。例如，在Backes 等人中引入了蛋白质中iMTS-L含量的定量测量，即iMTS-L倾向。（2018）。它可用于从单个数字中的完整配置文件汇总iMTS-L信息。

笔记

在将序列提交给TargetP时，始终选择适当的选项非常重要。特别是有机体（植物/非植物）可以显着影响形态。
本协议中描述的方法不限于使用TargetP。将该方法适用于其他预测算法是很简单的，例如MitoFates（Fukasawa et al。，2015）或PSort（Horton et al。，2007）。我们没有测试这些，但它们可以作为补充预测来识别“高可信度iMTS-Ls”。当然，也可以使用除线粒体前序列之外的特征的预测程序。 TargetP还提供信号序列或质体转运肽的评分。
虽然据报道iMTS-Ls作为线粒体前体中的Tom70结合位点（Backes et al。，2018），但它们也存在于非线粒体蛋白中。鉴于线粒体前序列通常构成分子伴侣的良好结合位点，如Hsp70（Okamoto et al。，2002），iMTS-Ls的检测也可能对蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究很有意义，尤其是蛋白质伴侣相互作用。

致谢

TargetP识别内部靶向序列的潜力最初由MichaelW.Wöllhaf认可（Woellhaf 等人，2016）。通过实验室实验，Sandra Backes，Steffen Hess和SabrinaGödel证实内部TargetP谱是预测线粒体前体蛋白输入能力的可靠指标（Backes et al。，2018）。这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（He2803 / 9-1，DIP Mito-Balance和IRTG 1830至JMH）和Landesschwerpunkt BioComp的资助。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

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