材料和试剂

10μl过滤器吸头长（SARSTEDT，目录号：70.1116.210）
20μl过滤嘴（SARSTEDT，目录号：70.760.213）
300μl过滤嘴（SARSTEDT，目录号：70.765.210）
1,000μl过滤嘴（SARSTEDT，目录号：70.762.211）
10-cm细胞培养皿（VWR，Thermo Fisher Scientific，目录号：734-2043）
克隆盘，尺寸5 mm（Sigma-Aldrich，SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：Z374458-100EA）
一次性玻璃巴斯德吸管150毫米（VWR，目录号：612-1701）
血清移液器，2 ml（VWR，Corning，目录号：734-1690）
血清移液器，5 ml（VWR，Corning，目录号：734-1737）
15毫升离心管（Corning，目录号：430791）
2毫升微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.691）
1,000μl移液器吸头ART ® 1000E阻隔吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：2079E）
用于细胞培养的12孔板（VWR，Thermo Fisher Scientific，目录号：734-2156）
精密盖玻片，18 mm，硼硅酸盐玻璃0.17±0.005 mm（Carl Roth，目录号：LH23.1）
显微镜载玻片（VWR，目录号：631-1550）
含有编码eGFP标记的目的RBP的基因的细菌人工染色体（BAC）（Botti et al。， 2017和Poser et al。，2008;见注释1- 3）
用于表达不同颜色的荧光质膜标记物的质粒（例如，CAAX-mCherry，质粒TH0477，Stewart 等人，2011; Botti 等。，2017;见注4）
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂，丙酮酸盐（Thermo Fisher Scientific，目录号：31966047）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：10270106）
青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
嘌呤霉素10 mg / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：A1113803）
Geneticin ®选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10131035）
胰蛋白酶0.05％EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25300054）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
H 2 O中2％明胶溶液生物试剂（Sigma-Aldrich，目录号：G1393）
环己酰亚胺溶液100 mg / ml，在DMSO中（Sigma-Aldrich，目录号：C4859）
聚乙二醇（PEG）1500在75 mM HEPES中（Roche Diagnostics，目录号：10783641001）
磷酸盐缓冲盐水10x（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
Pierce 16％甲醛（w / v），不含甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：28908）
30.水，分子生物学试剂（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
ProLong ®金刚石抗褪色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：P36970）
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P7949）
Tris（Carl Roth，目录号：4855.2）
Hoechst 34580（Sigma-Aldrich，目录号：63493）
Trizma ® base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钠（NaCl），BioXtra（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
盐酸36.5-38.0％（HCl），用于分子生物学（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
DMEM含有10％FBS，100 U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素（见食谱）
含0.1％明胶的PBS（见食谱）
10倍TBS（见食谱）
TBST（见食谱）
1x PBS中含4％甲醛（参见食谱）
Hoechst 34580原液（1 mg / ml）（见食谱）
含有0.25μg/ ml Hoechst 34580的TBST（见食谱）

设备

血球
计时器
通风柜
细胞培养罩（Thermo Fisher Scientific，型号：Herasafe TM KSP，型号KSP 12）
细尖弯曲镊子
P10移液器（VWR，目录号：613-5259）
P20移液器（VWR，目录号：613-5260）
P200移液器（VWR，目录号：613-5263）
P1000移液器（VWR，目录号：613-5265）
微型真空泵，KNF（A. Hartenstein，目录号：AP86）
液体抽吸系统（VACCUBRAND，型号：VHCpro）
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell TM 150i）
涡旋混合器（VWR，目录号：444-1372）
移液器控制器（accu-jet ® pro，品牌，目录号：26300）
-20°C冰柜
冰箱
倒置显微镜（Motic，型号：AE31）
共聚焦激光扫描显微镜（蔡司，型号：LSM 780）

软件

斐济（ImageJ版本2.0.0-rc-43 / 1.51h或更近）
Microsoft Excel（最新版本14.6.7或更高版本）

程序

有关定量异核运动穿梭试验的概述，请参见图1。

图1.定量异核运动穿梭试验概述。将表达GFP标记的核RBP的供体细胞与表达CAAX-mCherry的受体细胞一起接种到其细胞膜上。在环己酰亚胺存在下将细胞与PEG1500融合以阻断新的蛋白质合成，以避免RBP在普通细胞质中出现，而不是由于穿梭。 3小时后，固定细胞并通过共聚焦显微镜成像。适合于分析的异核体可以容易地鉴定，因为它们仅含有两个核，其中至少一个是绿色的，并且两者都被红色膜包围。通过共聚焦显微镜对细胞核进行成像，并在供体和受体细胞核中定量GFP荧光。鉴于允许在蛋白质合成抑制剂（环己酰亚胺）存在下进行穿梭，受体核中的任何荧光都是由于RBP的穿梭。

产生克隆转基因供体和受体细胞系
1. 如Botti 等（2017）和Poser 等所述，从随机整合到基因组中的BAC产生表达eGFP标记的目标RBP的供体细胞系。（2008）（见注1-3）。
2. 如Botti 等所述，从随机整合到基因组中的质粒中产生表达不同颜色的质膜定位标记（例如，CAAX-mCherry）的受体细胞系。 em>（2017）（见注4）。
3. 使用荧光激活细胞分选（FACS）或克隆盘，分离供体细胞系具有不同荧光水平的克隆和至少一个受体细胞系具有高荧光的克隆（参见注释5）。
4. 如果可获得针对目标RBP的特异性抗体，则通过蛋白质印迹法估计不同克隆中eGFP标记的RBP的表达水平，并选择具有接近内源水平的克隆。
准备供体和受体细胞的个体培养物
将供体和受体细胞传代到单独的10-cm培养皿上，1-3天后获得几乎融合的培养物。
混合并播种供体和受体细胞（时间：30分钟）（见注6）
1. 对于供体和受体细胞的每种组合，将4个无菌18-mm盖玻片放入12孔板的不同孔中。如果使用通常需要预涂表面的细胞系来增加其粘附性，则相应地预涂盖玻片。例如，P19细胞需要用含有0.1％明胶的PBS涂覆，并且当使用该细胞系时，我们通常在37℃下将盖玻片预涂覆24小时。
2. 估计供体和受体细胞的汇合（例如，50％，75％，100％）。
3. 吸出培养基并用5ml预热的无菌PBS轻轻洗涤。彻底吸出PBS并加入1.5ml 0.05％胰蛋白酶。在室温或37°C孵育3-5分钟（必须确定每个细胞系的最佳条件）。
4. 通过向每个方向倾斜板帮助细胞从餐具上脱离。
5. 加入3ml含有10％FCS的适当培养基（例如，DMEM）以抑制胰蛋白酶活性。
  关键步骤：使用移液器控制器上的最快速度设置，通过在细胞培养皿中上下移液20次来破坏细胞团块。确保通过在显微镜下目视检查获得供体和受体细胞的单细胞悬浮液。
6. 将每个单细胞悬浮液转移到15ml管中。
7. 使用标准方法（例如，使用血细胞计数器）计算供体和受体细胞悬浮液的浓度。或者，根据您的细胞系，培养皿（即，表面积）和汇合使用近似值。例如，具有在汇合处生长的HeLa细胞的10-cm培养皿含有约8.8×10 6个细胞，并且在步骤C3至C6之后，相应的细胞悬浮液（体积为4.5ml）将包含大约2.0×10 6 细胞/ ml。＆nbsp;
8. 在2毫升管中，制备2毫升1：1供体：受体混合细胞悬液，每个细胞悬液含有大约1×10 6个至2×10 6个细胞。细胞悬液。例如，如果供体细胞培养物约为50％汇合（每个培养皿约4.4×10×10 6个细胞），则受体细胞培养物约100％汇合（~8.8×10 6 < / sup>每个培养皿中的细胞），将1.333ml供体细胞悬浮液（~9.8×10 5 细胞/ ml）与0.667ml受体细胞悬浮液混合（~2.0×10 6 细胞/ ml）总共约2.6×10 6个细胞。＆nbsp;
9. 以中等速度将混合细胞悬浮液涡旋10秒。
10. 将1ml混合细胞悬浮液转移到含有1ml培养基（2倍稀释）的2ml管中。以中速涡旋10秒。这种和随后的稀释应有助于获得细胞融合和成像的最佳密度（参见程序I）。＆nbsp;
11. 类似地，再进行两次2倍连续稀释（相当于4倍和8倍稀释）。 8倍稀释应含有约2.5×10 5个/5μl至5.0×10 5个细胞。
12. 将1ml每种混合细胞悬浮液（未稀释的，2倍，4倍和8倍稀释）转移到步骤C1中制备的12孔板中的盖玻片上。确保盖玻片不浮在介质表面。如果他们中的一些人这样做，帮助他们使用无菌尖端在底部下沉。如果盖玻片预先涂覆（例如，含有0.1％明胶的PBS），则在添加混合细胞悬浮液之前从每个孔中吸取涂层溶液。
将细胞附着到盖玻片上（时间：过夜[8-16小时]）
在37°C，5％CO 2 孵育8-16小时。
关键步骤：孵育足够长的时间以使细胞附着在盖玻片上但短暂地足以避免细胞分裂。最近分裂的细胞容易融合在一起，通常导致含有两个以上核的异核体，这不应用于穿梭定量（参见方法I和J）。例如，小鼠P19细胞在指数生长期每16小时分裂一次，当使用该细胞系时，我们在此步骤孵育最多8小时（见注6）。
抑制蛋白质合成（时间：2.5小时）（见注7）
关键步骤：在此阶段，某些细胞系可能没有紧密附着在盖玻片上。为了防止细胞损失，在进行每次更换介质或清洗时要非常小心。应该遵循该建议直到细胞被固定（步骤H3）。始终在孔的侧壁添加培养基或缓冲液，而不是直接添加到盖玻片上。
1. 吸出培养基并轻轻加入1ml含有50μg/ ml放线菌酮（CHX）的培养基。在37℃下用5％CO 2 孵育2小时。
2. 吸出培养基并轻轻加入1ml含有100μg/ ml CHX的培养基。在37℃下用5％CO 2 孵育30分钟。
细胞融合（时间：30分钟）（见注8）
1. 吸出培养基并轻轻加入1ml含有100μg/ ml CHX的预热PBS。
2. 启动计时器2分钟和10秒。然后，一次一个盖玻片，吸出PBS / CHX并轻轻加入0.25毫升预热的PEG 1500.
  关键步骤：从盖玻片到盖玻片迅速（约10秒）进行。每个盖玻片应孵育2分钟（±几秒）。用一只手握住液体抽吸装置，用另一只手握住移液器控制器。对于抽吸，对所有样品使用相同的玻璃巴斯德吸管。要分发PEG 1500，请对所有样品使用相同的2 ml移液器。我们不建议在一批中处理超过12个盖玻片。
3. 在不移除PEG 1500的情况下，向每个盖玻片中轻轻添加3ml PBS。每个盖玻片保持约10秒的速度。
4. 吸出PBS并再用3ml PBS洗涤两次。
5. 吸出PBS并轻轻加入1ml含有100μg/ ml CHX的培养基。
6. 可选：在显微镜下简要地目视检查整体融合效率。在这个阶段可以观察到许多含有多个细胞核的细胞。
穿梭（时间：3小时）
在37°C孵育3小时，5％CO 2 （见注9）。
细胞固定和显微镜载玻片的制备（定时：1.5小时，过夜）
1. 吸出含有100μg/ ml CHX的培养基，加入1 ml含有100μg/ ml CHX的冰冷PBS。
2. 用1ml含有100μg/ ml CHX的冰冷PBS进行第二次洗涤。
3. 每次一个盖玻片，吸出含有100μg/ ml CHX的PBS，并轻轻加入0.5ml含有4％甲醛的冰冷PBS。避光，在室温下孵育20分钟。
  注意：甲醛有毒，应在通风橱中处理。
4. 用1ml PBS洗涤两次。
5. 取出PBS并加入0.5 ml含0.25μg/ ml Hoechst 34580的TBST。避光保存，在室温下孵育30分钟。
  注意：Hoechst 34580具有潜在的致癌性，因此应采取预防措施进行处理和处置。
6. 去除含有0.25μg/ ml Hoechst 34580的TBST，并用1ml PBS洗涤两次。将盖玻片从第二次洗涤中留在PBS中。
7. 使用精细弯曲的镊子，取出每个盖玻片，通过用盖玻片边缘接触餐巾尽可能多地去除PBS，然后转移（面朝上）到一张纸上。通过在旁边的纸张上书写来标记每个盖玻片。
8. 避光，让其完全干燥（至少15分钟）。
9. 每次一个盖玻片，将13.5μlProLong® Diamond Antifade安装试剂添加到显微镜载玻片上，用镊子取出盖玻片并将其倒置在滴安装试剂上。
  严重：避免将气泡吸移到载玻片上。
10. 避光，在室温下在水平表面上孵育至少16小时。
  暂停点：幻灯片可以在室温下存放24小时，然后在4°C下存放数周，直到成像。
成像（时间：每个样本4-6小时，15个异核体）
注意：我们建议针对每个供体细胞系（例如，表达感兴趣的eGFP标记的蛋白质）和受体细胞系优化成像设置（激发/发射波长，激光功率，增益，偏移等）。（例如，表达CAAX-mCherry）在盖玻片上单独生长并与样品平行处理。确保荧光团和设置的组合不会产生任何串扰。
1. 对于每个样品（即，对于每对供体 - 受体细胞系），通过视觉检查Hoechst荧光选择含有最佳细胞密度的盖玻片。细胞密度应该足够高，以便成对的细胞核经常彼此非常接近，但与周围的细胞核明显分开（见注10-12）。
2. 将物镜移向盖玻片的外围，直到细胞密度降低和/或细胞出现损坏，然后将物镜移回适合分析的区域（见注13）。
3. 使用Hoechst荧光对所需的细胞融合（供体 - 受体）事件进行系统搜索。融合细胞中的细胞核彼此非常接近并且通常显示出互补的形状，但情况并非总是如此（参见图2和3中的实例）。当使用来自两个不同物种（例如，小鼠和人类）的细胞时，有时可以通过存在对每个物种特异的不同异染色质模式来促进发现异核体（Borer et al。，1989）。注意，适于分析的异核体（即，明显仅含有一个供体和一个受体核）构成罕见事件（在检查的盖玻片上<0.01％的细胞）。
4. 在成像之前，确认两个细胞核都被mCherry通道中的一个共同的红色膜包围（见注14）。
5. 使用共聚焦显微镜采集设置，找到最佳焦点（Z轴上的细胞中间），定义要成像的区域并在所有三个通道中拍照（mCherry，eGFP和Hoechst，见图2和图3）。对给定分析中的所有图片使用相同的帧大小和分辨率;根据我们的经验，成像面积为67.4 x67.4μm，分辨率为1,024 x 1,024像素，可生成具有合理扫描时间的高质量图像，并且几乎总是允许我们从未融合的受体细胞中包含至少一个细胞核（或在至少部分）用于背景减法。
6. 在给定分析中，对于所有图片，使用相同数量的切片获取eGFP和Hoechst荧光的z-堆叠。根据我们的经验，间隔为0.31μm的10到12个切片允许覆盖Z轴上的几乎整个核。为了最大限度地减少扫描时间和eGFP荧光的漂白，我们建议首先对eGFP通道中的所有切片进行成像，然后对Hoechst通道中的所有切片进行成像。我们认为没有必要获得CAAX-mCherry的z-stack，因为它显着增加了扫描时间;但是，请确保将步骤I5中生成的图片作为两个细胞核来源于融合供体 - 受体细胞的证据。
7. 恢复对所需供体 - 受体细胞融合事件的系统搜索，并重复步骤I4至I6。我们建议每个样本至少成像15对核，以进行适当的统计分析。
  
  图2.可用于定量异核体分析的克隆供体和受体细胞系的实例。左上图，表达GFP标记的SRSF5的小鼠P19细胞，RBP与细胞质穿梭活性（Botti et al。，2017）用作供体细胞。 SRSF5-GFP在来自随机整合到基因组中的BAC的近内源水平表达，导致蛋白质在整个核质中的生理定位，同时富集核斑点。注意由于使用克隆细胞系，所有细胞中的GFP荧光水平高度相似。插图显示了小鼠P19细胞的特征Hoechst染色模式。右上图，在其细胞膜中表达CAAX-mCherry的人HeLa细胞用作受体细胞。由于在将质粒TH0477随机整合到基因组中后选择高表达克隆，CAAX-mCherry在所有受体细胞中以均一水平表达。插图显示了HeLa细胞的特征Hoechst染色模式。下图，上图中显示的供体和受体细胞系用于定量异核体测定。该图显示了异核体，即，一个细胞含有来自供体P19细胞的一个细胞核和一个来自受体HeLa细胞的细胞核，两者都被标有CAAX-mCherry的共同膜包围。插图显示了异核体的两个核的Hoechst染色模式。橙色星号表示未融合的HeLa细胞和黄色星号，未融合的P19细胞。注意GFP信号在受体HeLa细胞核中的显着存在以及其与未融合的HeLa细胞核的缺失（也参见图3）。还要注意在未融合的P19核周围的膜中没有CAAX-mCherry信号。比例尺=10μm。
  
  图3.使用定量异核体分析可以研究细胞类型特异性穿梭活动。左侧和中间小组，表达SRSF5-GFP的小鼠P19细胞用作供体细胞之前（左）和后（中）9天分化成神经细胞。右图，表达SRSF5-GFP的小鼠NIH3T3克隆细胞系用作供体细胞系。 SRSF5-GFP在多能（P19）细胞中有效穿梭，但在分化的（P19和NIH3T3）细胞中很差。参见Botti 等人（2017），以量化和比较SRSF5在这些不同细胞类型中的穿梭活性。注意未融合的HeLa细胞核完全没有GFP信号（用橙色星号表示）。比例尺：左图=5μm;中图=5μm;右图=10μm。
荧光图像分析和定量（定时：15个图像2-3小时）
1. 打开斐济（ImageJ版本2.0.0-rc-43 / 1.51h或更近）。
2. 选择“分析→工具→ROI管理器...”，打开感兴趣区域（ROI）管理器。
3. 打开图像（选择“查看堆栈：Hyperstack”，“颜色模式：复合”和“自动缩放”）。
4. 选择“图像→堆栈→Z项目...”，“开始切片：1”，“停止切片：10”（或12，包括所有切片），“投影类型：最大强度”。
5. 选择“图像→彩色→分割通道”。
6. 单击Hoechst通道中生成的图片，然后选择“图像→查找表→灰色”。
7. 选择“图像→调整→亮度/对比度”并使供体和受体核尽可能可见，同时仍能够将它们彼此区分开。
8. 如果供体和受体核彼此非常接近，则使用铅笔工具在它们之间画一条线。
9. 调整亮度和对比度，尽可能清楚地看到整个供体和受体细胞核。
10. 尽可能放大供体/受体核，使它们在窗口中完全可见。使用手绘选择，绘制供体细胞的边界。
11. 在ROI Manager窗口中，单击“Add [t]”。这将生成具有特定数字的ROI。
12. 在列表中，单击与ROI对应的数字，然后选择“重命名...”，然后选择“重命名为：图像1捐赠者”。
13. 绘制收件人核心的边框，添加到ROI管理器并重命名为“Image1收件人”。
14. 根据需要缩小并放大未融合的受体细胞的细胞核。
15. 从未融合的收件人单元格中绘制核心的边界，添加到ROI管理器并重命名为“图像1背景”。
16. 单击原始（.czi）图片并选择“图像→堆栈→Z项目...”，“开始切片：1”，“停止切片：10”（或12，包括所有切片）和“投影类型：总和切片” “（见注15）。
17. 选择“图像→彩色→分割通道”。
18. 单击eGFP荧光图像，然后选择“图像→类型→16位”。
19. 在ROI Manager窗口中，选择与供体细胞核相对应的ROI，然后单击“测量”。 “结果”窗口将打开。确保生成以下数据：面积，平均值，最小值，最大值和切片。
20. 在ROI Manager窗口中，选择与收件人核相对应的ROI，然后单击“Measure”。
21. 重复背景核。
22. 关闭所有图像并使用图像2重复步骤J3至J21。
23. 要保存文档的投资回报率，请在投资回报率管理器中选择“更多＆gt;＆gt; ...保存”。
24. 通过单击“结果”窗口并选择“文件→另存为...”将结果保存在Microsoft Excel文件中。
25. 打开Excel文件。对于每个图像，从供体核和受体核中减去未融合的受体核的平均像素强度（平均值）。这产生每个核的背景减去的平均像素强度。
26. 对于供体核和受体核，将背景减去的平均像素强度乘以该面积以获得总像素强度。
27. 将受体核的总像素强度除以供体核的总像素强度并乘以100以获得穿梭能力的值（％）。

数据分析

为了比较两种不同条件下蛋白质的穿梭或两种不同蛋白质的穿梭，我们建议至少在两次独立实验中每种条件或蛋白质至少成像15个异核体（例如，7-8来自两个独立实验的每个盖玻片的异核体。）＆nbsp;
在给定条件下蛋白质的平均穿梭活动应该从至少15个异核体图像计算出来。＆nbsp;
我们应用学生的 t - 测试和配对的Wilcoxon秩和检验来测试不同条件或蛋白质之间的穿梭活动是否显着不同。为此，将所有量化的和减去背景的穿梭能力值组合成列，将蛋白质名称作为标题放入.txt文件中。绘图和测试在R中进行。
示例：
read.table（“/ path / Quantification_HKA.txt”，head = TRUE，sep =“\ t”） - ＆gt; experiment_HKA
摘要（experiment_HKA）
boxplot（experiment_HKA，las = 2，ylab =“穿梭容量HKA”），boxfill = c（“lightgrey”））
wilcox.test（experiment_HKA $ Control，experiment_HKA $ Mutant，配对= TRUE）

笔记

细菌人工染色体（BAC）中的蛋白质标记和随后的转基因细胞系的产生已在（Poser 等人，，2008）中详细描述。
穿梭测定的读数是蛋白质从供体到受体细胞核的重新分布。在最初的测定中（Borer et al。，1989），使用物种特异性单克隆抗体通过间接免疫荧光定性评估受体核（来自不同物种）中感兴趣的蛋白质的出现。然而，对于某些蛋白质，特异性抗体很难 - 如果不是不可能的话 - 产生。为了避免这种情况，在与受体细胞融合之前，用编码感兴趣的蛋白质的表位标记的cDNA瞬时转染细胞（Pinol-Roma和Dreyfuss，1991; Caceres et al。，1998; Lin 等人，2005）。然而，来自质粒的瞬时表达经常导致过表达，这反过来会影响RBP的功能和亚细胞分布（Maharana et al。，2018;我们未发表的观察结果）。此外，RBP水平将在不同细胞之间发生显着变化，从而排除了可比较的异核体的鉴定。为了克服这些限制，我们强烈建议使用稳定表达来自细菌人工染色体（BAC）的荧光标记蛋白的克隆细胞系，这些蛋白已经以单拷贝整合到基因组中（Poser et al。，2008; Botti） e t al。，2017）。大尺寸的BAC确保所有基因调控元件（例如，启动子，增强子，内含子序列和非翻译区域）的存在，这保留了剪接同种型的内源比率，并导致表达水平与内源基因（图2，Änkö et al。，2012;Müller-McNicoll et al。，2016; Botti et al。，2017 ）。或者，可以使用CRISPR / Cas9的基因组编辑将荧光标签引入由其内源基因座表达的RBP中（Van Nostrand 等人，，2017）。
我们还建议在每个实验中使用对照细胞系。我们已经使用表达eGFP标记的PRPF8（剪接体组分）和核输出因子（NXF1）的细胞分别作为穿梭的阴性和阳性对照（Botti 等人，，2017）。可以使用已经确认或排除穿梭的其他RBP。然而，应该记住，给定RBP的穿梭可能根据细胞类型和/或分化状态而变化（图3，Botti 等。，2017; Hammarskjold et al。，2017）。
为了容易地鉴定真正的异核体，我们的测定法需要使用仅在受体细胞中表达的膜标记物。我们成功地使用克隆受体细胞系来表达随机整合到其基因组中的质粒的CAAX-mCherry（TH0477，Stewart et al。，2011; Botti et al。，2017 ）。 CAAX是异戊二烯化肽，其与细胞膜结合（Wright和Philips，2006）。然而，其他膜标记可能同样适合。使用质粒的稳定转基因细胞系可以基本上与使用BAC时相同的方式产生。见注1。
我们的测定基于定量细胞成像，其需要具有相同设置（激光功率，增益，数字偏移，等）的标准化成像协议以获取所有图像。为了实现这一点，我们强烈建议对供体和受体细胞系使用克隆系，优先选择研究的RBP的内源表达水平。克隆细胞系可以通过FACS分选获得，其需要访问专门的核心设施或合格技术人员的帮助，或者没有使用克隆盘的任何专门设备或专业知识。
该方案最关键的部分：为了产生可靠的结果，只应量化含有一个供体和一个受体细胞核的异核体。为了增加可检查的异核体的频率 - 从而减少显微镜检查时间/增加统计功效 - 应该以下列三种方式针对供体 - 受体细胞系的不同组合优化实验条件。
＆NBSP;首先，使用适当比例的供体和受体细胞。原则上，应使用1：1的比例（并且是一个良好的起点）以增加异核体含有一个供体和一个受体核的可能性。然而，不同的细胞类型或多或少地紧密粘附于玻璃盖玻片，并且鉴于在细胞融合之前必须进行若干培养基更换/洗涤，该比例可能必须根据所用细胞的组合进行优化。此外，一些细胞系具有比其他细胞系更快的生长速率，并且应该在强附着和低数量的细胞分裂之间进行折衷，因为最近分裂的细胞倾向于融合在一起并且降低可检查的异核体的频率。例如，当我们使用快速分裂的小鼠P19细胞作为供体和HeLa细胞作为受体时，我们允许比使用具有相同接受者的小鼠NIH3T3细胞（12-16小时）更短（6至8小时）的粘附时间以避免P19细胞分裂，但我们使用P19：HeLa细胞比例为2：1或3：1，因为P19细胞比HeLa和NIH3T3细胞更快和更强地粘附到盖玻片上，并且在洗涤期间许多P19细胞丢失。当使用需要涂层的细胞类型（例如，明胶，层粘连蛋白，等）时，我们建议将盖玻片预孵育足够的时间，最好是37小时。 °C，在播种细胞之前。
＆NBSP;其次，在混合和接种之前获得供体和受体细胞的单细胞悬浮液是至关重要的。这可能需要严厉地上下移液以打破细胞团块。不要犹豫牺牲一些细胞的活力来获得真正的单细胞悬浮液。
＆NBSP;第三，使用最佳细胞密度。为了获得异核体，细胞应粘附在彼此足够接近的盖玻片上，以便它们的膜可以在化学处理时融合（见下文）;但是，应将细胞悬液稀释到足以避免多次融合事件。为了找到单次和多次融合之间的最佳折衷，我们建议在接种前进行连续2倍稀释的混合（供体 - 受体）细胞悬液，并通过显微镜确定最佳稀释度以寻找合适的异核体。尽管使用表达荧光膜标记的受体细胞系极大地促进了适合于分析的异核体的鉴定，但是在单个供体和单个受体细胞之间发现明显的融合事件仍然具有挑战性，并且值得投入一些时间来确定最佳用于进行搜索的稀释液。
核蛋白质在细胞质中合成。为了确定核蛋白是否穿梭于细胞质并返回细胞核，因此在穿梭测定之前和期间阻断蛋白质合成是必要的。以这种方式，受体核中任何新出现的荧光蛋白应该来自供体细胞核，而不是来自其共同细胞质中新合成蛋白质的库。确认的非穿梭核RBP（例如，剪接因子PRPF8; Sapra 等，2009）应始终用作阴性对照;没有穿梭确认了有效的蛋白质合成抑制。我们使用了两种不同的蛋白质合成抑制剂（放线菌酮和嘌呤霉素），产生了基本相似的结果（Botti et al。，2017）。
聚乙二醇（PEG）是水溶性的，因此可以通过洗涤容易地除去;然而，延长孵育对大多数细胞系可能是有毒的（我们的观察结果）。在比较穿梭分析中对所有样品使用相同的孵育时间是很重要的。
细胞融合后，应该允许足够的时间来检测和测量感兴趣的RBP的穿梭。有几个因素会影响给定蛋白质的穿梭效率。我们已经证明SR蛋白家族的不同成员以不同的速率穿梭，这与其可磷酸化的RS结构域的长度相关（Botti 等，，2017）。根据RBP的生物学功能，穿梭率可能有很大差异。例如，虽然一些核蛋白如核仁蛋白似乎慢慢“泄漏”到细胞质，需要在受体细胞核中检测到约24小时，但可以在几分钟内检测到核质转运因子的穿梭（Gama-Carvalho et al。，2001）并在3小时内达到平衡（即，50％在供体和受体细胞核中）（Caceres et al。，1998; Sapra et al。，2009; Botti et al。，2017）。在比较不同RBP的穿梭效率时，在细胞达到平衡之前固定细胞至关重要。此外，为了使变化最小化，应该允许在每次重复分析中穿梭完全相同的孵育时间。
＆NBSP;影响穿梭效率的另一个因素是供体和受体核的组合。例如，如果给定的蛋白质从供体细胞核输出但不从受体细胞核输出，则蛋白质可能被捕获并在受体细胞核中积聚，蛋白质的穿梭能力可能看起来比实际上更大，有时达到超过50％（未发表的观察）。在这种情况下，可能需要减少穿梭时间，以便能够量化差异（例如，突变体和WT蛋白之间）。
＆NBSP;最后，供体和受体细胞核的细胞周期阶段在某些情况下可能影响研究中蛋白质的穿梭能力。在分裂细胞的间期期间，核体积和NPC的数量几乎翻倍（Maeshima et al。，2011）。理论上，较大的核应该允许更快的进口和较慢的穿梭蛋白输出，因为其较大的表面积与细胞质接触并且其较小的表面区域与核质接触。我们观察到较大的受体核往往具有较高的总荧光水平（未发表的观察结果）;然而，当对足够数量的异核进行成像时，这种效果不会显着影响结果。然而，一些蛋白质的穿梭可能在整个细胞周期中变化，并且在一些情况下，在融合之前同步细胞（例如，在G1中）可能是有用的。
如果没有盖玻片显示最佳密度，则在随后的实验中调整稀释度。
一些细胞融合事件似乎只发生在相同细胞系（供体细胞系或受体细胞系）的细胞之间。一个可能的原因是供体或受体细胞的生长速度更快。如果一个细胞系生长太快，请尝试在步骤D1减少附着时间。
在一些情况下，尽管在步骤C8中使用了供体：受体细胞比例为1：1，但是一种细胞类型（供体或受体）似乎在载玻片上占优势。一个可能的原因是不同的细胞类型或多或少地牢固地附着在盖玻片上，并且在培养基更换和洗涤期间供体细胞或受体细胞可能以更高的速率丢失。
盖玻片周边的细胞有时不适合成像/分析：根据Hoechst荧光，它们的细胞核可能看起来更小，更亮和不规则，并且它们的特定染色质特征可能不太明显。这些细胞的荧光水平在eGFP和mCherry通道中倾向于较低。这些区域包含可能受损的细胞。
获取正确量化所必需的Z-堆栈是耗时的。在其膜中使用具有荧光标记的受体细胞（例如，，CAAX-mCherry）允许容易地区分真正的异核体与仅仅非常接近但未融合的供体/受体细胞。如果在显微镜下快速观察表明它是真正的异核体，那么继续进行成像。否则，继续搜索合适的异核体。
即使在成像期间已经注意避免像素饱和，切片的总和将使一些像素看起来饱和。这应仅影响感兴趣区域中的少数像素，并且根据我们的经验，它不会显着影响结果。但是，如果有人怀疑太多像素在切片总和中出现饱和并且这可能会影响分析，那么荧光应该在单独的切片中量化，然后求和。

食谱

DMEM含有10％FBS，100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素
1. 将50ml热灭活的FBS加入500ml DMEM中
2. 加入5毫升青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）
3. 充分混合并储存在4°C（保持无菌）
含有0.1％明胶的PBS
1. 将25毫升2％明胶加入500毫升无菌1x PBS中
2. 充分混合并储存在4°C（保持无菌）
10x TBS（1升）
1. 将24克Trizma ®碱和88克NaCl溶于900毫升dH 2 O中
2. 用HCl调节pH至7.6
3. 将体积调节至1 L并验证pH值
4. 在RT存储
TBST（1升）
1. 将100ml 10x TBS加入900ml dH 2 O中
2. 加入0.5毫升吐温® 20
3. 混合均匀并在室温下储存
1x PBS中4％甲醛（40 ml，80粒盖玻片）
1. 在50毫升管中，加入4毫升10倍PBS至26毫升H 2 O（Sigma
2. 在通风橱中，加入10毫升16％的甲醛
3. 通过涡旋混合10-15秒
4. 以-20毫升的等分试样储存于-20°C（每个等于8个盖玻片）
Hoechst 34580原液，1 mg / ml（5 ml）
1. 将小瓶（5 mg）的全部内容物溶解在5 ml H 2 O（Sigma）中
2. 以-20℃的等分试样储存，避光
Hoechst34580,0.25μg/ ml TBST（4 ml，8次盖玻片）
1. 在15毫升管中，加入1微升1毫克/毫升Hoechst 34580至4毫升H 2 O（Sigma）
2. 通过涡旋混合10-15秒
3. 准备新鲜，保持在冰上并避光

致谢

这项工作得到了德国研究基金会（DFG）向MMM（CEF-MC和SFB902）的资助。我们感谢M. C. Steiner开发第一个测定版本和K. M. Neugebauer的灵感和指导。我们感谢H. Schewe（FCAM）对共聚焦显微镜的支持。该方案改编自Botti 等人发表的程序。（2017）。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

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