材料和试剂

多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich）
5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）（Sigma-Aldrich）
亚铁氰化钾（Sigma-Aldrich，目录号：B4252）
铁氰化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9387）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
氢氧化钠
二甲基甲酰胺
氯化钠
氯化镁
磷酸二钠
柠檬酸
磷酸钠
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）
衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色溶液（参见配方）

设备

倒置显微镜[ Olympus 1 x 71倒置显微镜（奥林巴斯）]
24孔板
p1000移液器
37℃孵育器
热板

程序

用于SA-β-gal染色测定的细胞操作可以在24孔板格式中进行。
准备每个样品一式三份。
在转染后120小时或细胞操作后，吸出细胞培养基，用PBS（500μl/孔）洗涤细胞两次，使用p1000移液管。
最后一次冲洗后，用250μl的4％PFA替换PBS固定。
在室温下孵育细胞5分钟。
吸出4％PFA，洗涤细胞两次，每次5分钟，在室温下与500微升PBS轻轻摇动。
每孔加入250μlSA-β-gal染色溶液。
孵育细胞在黑暗中37℃的孵化器。
当细胞染成蓝绿色时，终止反应，如在倒置明场显微镜下可见。
要终止反应，请吸出染色溶液并更换蒸馏水。
在蒸馏水中第二次洗涤细胞。
最后一次洗涤后，向每个孔中加入500μl蒸馏水，并在倒置明场显微镜下观察板。
使用10x物镜捕获每个孔中的细胞的图像。
可以打印图像以计数总细胞数目，或在计算机监视器上计数染色的细胞，这可以在未染色和染色的细胞之间给出更好的区别。
代表SA-β-gal阳性细胞占总细胞数的百分比。
注意：可能需要进行试验，以确定每个待研究的细胞系与SA-β-gal染色溶液孵育的最佳长度。在前12小时期间每4小时观察细胞，随后每12小时观察细胞。例如， PAX8siRNA处理的样品），而不是在对照样品（未处理的样品或/和对照siRNA处理的样品）中。重要的是记住，该测定的检测原理是基于溶酶体β-半乳糖苷酶的细胞丰度，其在细胞系之间变化。显示我们手中的几种细胞系的最佳孵育时间的长度的表如下（表1）。

表1. 细胞系中SA-β-gal活性出现所需的孵育时间示例

单元格行	孵育时间（h）
A498（肾细胞癌）	24
786-O（肾细胞癌）	24
TK-10（肾细胞癌）	12
K1（甲状腺癌）	12

图1A图示了在四种细胞系中响应于PAX8敲低检测到的增加的SA-β-gal活性的外观。明场图像显示蓝绿色SA-β-gal阳性细胞（插图）。使用Adobe Photoshop（版本10.0）颠倒图像的颜色以帮助阳性（粉红色）细胞的可见性。 SA-β-gal阳性细胞在对照siRNA（SN）处理的样品（在TK-10细胞中，最高检测为3％，图1B）中检测不到（或以非常低的频率）。相比之下，在所有PAX8siRNA（S8）处理的样品中观察到SA-β-gal阳性细胞的不明显升高（在TK-10细胞中最高检测为38％）。

图1。用SA-β-gal染色测定法鉴定衰老细胞。在siRNA处理后120小时测定用对照siRNA（SN）或PAX8 siRNA（S8）处理的细胞的SA-β-gal活性。 A.亮场图像显示在插图中。使用Adobe Photoshop反转这些图像以帮助阳性细胞（粉红色）的可见性。白色箭头表示来自染色溶液的沉淀。放大100倍。 B.显示处理样品中阳性细胞（总细胞数）百分比的图。

食谱

4％多聚甲醛（PFA）
为了制备100ml 4％PFA，在连续搅拌下在热板上（溶液不超过60℃）溶解4g PFA在100ml PBS中。加入20μl1M氢氧化钠溶解残余的PFA。等分并在-20°C冷冻长期储存。
衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色溶液
首先，准备以下储备溶液。
1. 为了在二甲基甲酰胺（DMF）中制备10％X-gal，将10ml X-gal溶解在10ml DMF中。将储备的X-gal溶液储存在-20°C。
2. 400mM柠檬酸/磷酸钠溶液中加入36.85ml 0.1M柠檬酸至63.15ml 0.2M磷酸氢二钠。如果需要，用0.1M柠檬酸验证pH并调节至pH6.0。
3. 0.5M亚铁氰化钾和0.5M铁氰化钾，在4℃黑暗中储存亚铁氰化钾和铁氰化钾的储备溶液。
为了制备SA-β-gal染色溶液，用水适当稀释储备溶液，得到含有0.1％X-gal，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，150mM氯化钠和2mM氯化镁的溶液在40mM柠檬酸/磷酸钠溶液，pH 6.0中。

致谢

该协议基于与Li等人（2011）中公布的相同的协议。 MRE希望承认奥塔哥大学领导思想家进步运动和新西兰癌症研究信托研究所的支持。 CGL希望承认健康研究委员会，奥塔哥国际费用奖学金和研究生出版奖学金和达尼丁医学院完成您的博士奖学金的奖学金支持。支持该协议实施的研究补助金来自新西兰健康研究委员会和奥塔哥大学医学院信托基金。

参考文献

Dimri，GP，Lee，X.，Basile，G.，Acosta，M.，Scott，G.，Roskelley，C.，Medrano，EE，Linskens，M.，Rubelj，I.，Pereira-Smith，等。（1995）。在体内识别文化和衰老皮肤中的衰老人类细胞的生物标志物。 Proc Natl Acad Sci USA 92（20）：9363-9367。
Kurz，D.J.，Decary，S.，Hong，Y。和Erusalimsky，J.D。（2000）。衰老相关（β） - 半乳糖苷酶反映溶酶体质量的增加在人内皮细胞的复制性老化期间。 J Cell Sci 111（Pt 20）：3613-3622。
Li，C.G.，Nyman，J.E.，Braithwaite，A.W.and Eccles，M.R。（2011）。 PAX8通过转录调节E2F1和稳定RB蛋白来促进肿瘤细胞生长。 Oncogene 30（48）：4824-4834。
Miller，J.H。（1972）。分子遗传学实验。 Cold Spring Harbor Laboratory xvi，466 p.pp.