材料和试剂

小肠结肠炎耶尔森菌菌株YeO3-R1（al-Hendy等人，1992）
Cat-Mu转座子（Haapa等人，1999）或等同物如Entranceposon Cam-R3（Thermo Fisher Scientific，Finnzymes，目录号：F-778）
MuA转座酶1,100ng /μl和MuA储存缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Finnzymes，目录号：F-750C）
99.5％甘油BD H（目录号： 24388.320）
10％Triton X-100（w/v）（F.Hoffmann-La Roche，目录号：11332481001）
超纯0.5M EDTA（pH 8.0）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15575）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
Centricon YM-100（100-kDa cutt off）（EMD Millipore，目录号：UFC210024PL）
聚乙二醇（PEG）6000（Merck KGaA，目录号：8.07491）
NuSieve 3：1琼脂糖（25g）（Lonza，目录号：50091）
来自牛血清，BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）的白蛋白，
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
Ficoll PM 400（Sigma-Aldrich，目录号：F4375）
细菌用琼脂，细菌用胰蛋白胨和细菌用酵母提取物（BD Difco）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
胰蛋白酶大豆肉汤（Oxoid Limited，目录号：CM0129）
由Y产生的肠念珠菌。肠结肠炎血清型O：7,8株29930（Strauch等人，2001）
MuA存储缓冲区
醋酸钠（NaAc）
DNA梯度（New England Biolabs）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
TGD缓冲区（参见配方）
5x复合缓冲液（见配方）
1 M DTT（见配方）
20％PEG6000（w/v）-2.5M NaCl（5ml）（参见配方）
不含镁的SOB培养基（1L）（参见配方）
2 M Mg ++原料（见配方）
2 M葡萄糖（100 ml）（见配方）
SOC培养基（100ml）（参见配方）
Luria肉汤（LB）培养基（1L）（见Recipes）
LB琼脂（LA）平板（1L）（参见配方）
氯霉素（Clm）溶液（10ml）（参见配方）
胰蛋白酶大豆肉汤（见Recipes）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（1L）（参见Recipes）
TAE缓冲区（请参阅配方）

设备

离心机（Sorvall，Heraeus Holding）
水浴（格兰特）
孵化器（Termaks）
摇床（New Brunswick Scientific）
生物测定仪（Eppendorf）
琼脂糖凝胶电泳（Bio-Rad Laboratories）
凝胶文件设备（Bio-Rad Laboratories）
电穿孔仪（Bio-Rad Laboratories，Genepulser II）
90mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Sterilin ，目录号：101RT）
0.1-cm电穿孔杯（Bio-Rad Laboratories）

程序

转置复合体装配（Lamberg等人，2002）

使用Cat-Mu（1250-bp）转座子作为供体DNA制备八个标准装配反应。 Cat-Mu（或等价物）是可商购的。或者，可以在其载体质粒的上下文中构建定制的转座子，通过BglII消化分离并如所述通过阴离子交换层析纯化（Haapa等人，1999）。
在室温下混合ddH 2 O，甘油和5x复合缓冲液，并在冰上转移管。根据下表采取适当体积的试剂。
添加您的供体DNA。
用冷MuA储存缓冲液稀释最终浓度为400 ng /μl的MuA转座酶。只稀释所需的量。保持MuA一直在冰上。 Pipet MuA上下取下等分试样或加入反应中，因为它是一种粘性蛋白质。

添加MuA，并将管直接转移到30°C水浴。彻底混合！

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零件	量（μl）	最后
ddH 2 O	16	最终体积80μl
99.5％甘油	40	50％
5x复合缓冲液	16	1x
Cat-Mu（1.1pmol/907.5ng /μl）	4	4.4pmol
MuA转座酶（400ng /μl）	4	1,600ng

在30℃孵育4小时。

集中你的复合物
1. 组装后，汇集反应，并且如所述（Pajunen等人，2005）使用Centricon YM-100（100-kDa截留，Millipore）离心筒将反应产物浓缩（〜10倍）并脱盐。将汇集的装配反应用TGD缓冲液稀释至2ml，施加在Centricon上，离心30分钟1000×g，用1ml TGD缓冲液洗涤一次（15分钟1,000×g ），最后用300×g的反向旋转回收2分钟。 Centricon浓缩器后的典型体积为40至70μl。
2. 或者，可以使用如（Paatero等人，2008）所述的聚乙二醇（PEG6000）沉淀进行浓缩步骤。
3. 池8 x 80微升组装反应= 640微升。
4. （可选：取5μl转移复合凝胶样品）
5. 加入380μl过滤灭菌的20％PEG6000 - 2.5 M NaCl。每次你集中你的复合体准备新鲜的解决方案。
6. 在冰上孵育（沉淀）60分钟。
7. （可选：取5μl样品用于凝胶，如上）
8. 在微量离心机中在4℃下离心60分钟13,000rpm。
9. 小心弃去上清液，不影响沉淀。
10. 重悬在50μlTGD缓冲液中的沉淀。 Cat-Mu转座复合物制剂的计算浓度为580.8ng /μl
11. 将颗粒在冰上溶解60分钟或过夜。点击管以帮助丸粒溶解。
12. 将制备物在液氮中冷冻并储存在-80℃。置换复合物可以在-80℃下储存几个月，甚至长达1年，而不会失去活性
13. 可以通过如下的琼脂糖/肝素/BSA凝胶监测转座复合物的装配和浓度（参见图1）。
14. 制剂的转位活性可以通过使用质粒DNA作为靶的体外转座试验和将反应产物引入感受态细胞中来测量。大肠杆菌细胞（Haapa等人，1999）。回收氯霉素抗性菌落是功能性转座复合体的指示
转位复合凝胶
1. 制备琼脂糖/肝素/BSA凝胶（2x TAE中的2％NuSieve 3:1，87μg/ml肝素，87μg/ml BSA）。
2. 在250-ml烧瓶中测量1g NuSieve 3：1琼脂糖。
3. 加入49ml ddH 2 O，并再次称重烧瓶（应为约49g）。
4. 在微波炉中熔化琼脂糖（或等同物）
5. 再次称重烧瓶，加入H 2 O，使最终重量为49g。
6. 加入1ml 50x TAE缓冲液。
7. 当溶液为约55℃时，加入43.5μl的肝素100mg/ml和109μl的BSA 40mg/ml。
8. 制备凝胶样品。对于非浓缩复合物（5μl样品），加入0.5μl肝素65mg/ml和1μl25％Ficoll PM 400（w/v）。对于浓缩复合物，取0.5-1μl样品;加入ddH 2 O 2至5μl体积，然后加入肝素/Ficoll，如上所述。
9. 在1X TAE中在80V（5V/cm）下运行凝胶2小时。最好用泵循环缓冲液。
10. 用溴化乙锭0.5μg/ml在1x TAE中凝胶化凝胶60分钟。如有必要，染色可以延长一夜。
11. （可选：将凝胶在1x TAE或ddH 2 O中脱色20分钟）
12. 拍摄照片（图1）。
  
  图1. Em-Mu（1447-bp）复合物的代表性转座复合物凝胶（Pajunen等，2005）。泳道1,300ng的2 -log DNA梯。泳道2，5μl来自汇集装配反应的样品（250ng供体）。泳道3，10μl来自离心前PEG沉淀的样品（326ng）。泳道4，10μl来自上清液的样品。泳道5，0.61μl来自溶解在TGD缓冲液中的浓缩复合物的样品（410ng供体DNA，泳道6,1μl 来自浓缩复合物（665ng供体DNA）的样品。泳道7，未组装的对照，仅410ng供体DNA。大约。 3.5kb带响应于单个转座子（C1）末端之间的复合物形成，参见Lamberg等人（2002）对于Cat-Mu复合物凝胶。
电感受态细胞的制备（Lamberg等人，2002）
1. 在100ml烧瓶中将新鲜的YeO3-R1菌落接种到25ml SOB培养基（不含镁）中。在37℃下剧烈通气使细胞生长过夜。
2. 在3L烧瓶中将0.5ml过夜培养物稀释到500ml SOB中。生长2-3小时，在37℃剧烈通气直到OD 600 = 0.8。
3. 在冰上孵育30分钟。
4. 分成三个250毫升瓶。通过在Sorvall GSA（或等价物）转子中在5,000rpm（2,600xg）下在4℃下离心10分钟收获细胞。
5. 通过将每个重悬于5ml无菌冰冷的洗涤缓冲液（10％甘油，90％蒸馏水，v/v）中来洗涤细胞沉淀。保持瓶子在冰上的所有时间。
6. 合并成两瓶。
7. 每瓶加入200毫升冰冷的洗涤缓冲液，倒置瓶子几次混合
8. 在4℃下以5,000rpm（2,600×g）离心细胞悬浮液15分钟，并在转子停止时小心地倒出上清液。在洗涤缓冲液中洗涤的细胞不会沉淀。如果上清液浑浊，请增加离心时间
9. 通过重悬于5ml无菌冰冷的洗涤缓冲液中，再次洗涤细胞沉淀。加入200毫升洗涤缓冲液，倒置瓶子几次混合。
10. 以5,000 rpm离心细胞悬浮液15分钟。
11. 倒出上清液，并将细胞悬浮在留在离心瓶中的洗涤缓冲液中。组合成单瓶。最终体积为约2ml（〜1×10 11细胞/ml）。
12. 在冰上孵育至少30分钟，优选60分钟。
13. 细胞可以立即使用或可以等分冷冻。对于一些菌株，如YeO3-R1，新鲜细胞产生更好的效率。
14. 对于冷冻分离60微升（或120微升）在无菌冷微量离心管中。在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
制备转座子插入文库（Pinta等人，2012）
1. 为了产生文库，如下进行8次个别电穿孔。
2. 取50μl新鲜制备的electrocompetent YeO3-R1细胞。在冰上与1.7μl（990 ng;优先使用800 - 1,000 ng的配合物，以获得最高效率）的Cat-Mu转座复合物制剂混合。
3. 将混合物转移到预冷的0.1厘米电极间距比色皿，并使用Genepulser II进行电穿孔，具有以下设置：200Ω，1.8kV，25μF。
4. 加入1ml预热的SOC培养基，并将来自单个电穿孔的悬浮液在50ml烧瓶中混合。
5. 在28℃下搅拌（220rpm）生长细菌50分钟。
6. 加入3.3ml 50％甘油至15％（v/v）的终浓度。
7. 将该文库作为等分试样（例如14x0.8ml）在液氮中冷冻，并储存在-80℃。
8. 为了估计文库中单个转座子插入突变体的数目，将一个等分试样解冻，并用氯霉素（10μg/ml）（LA-Clm）铺在LA板上。
9. 在28℃孵育1-2天（即，肠炎沙门氏菌的最佳生长温度），并计算菌落形成单位数（CFU）。
肠球菌素抗性突变体的分离（Pinta等，2012）
1. 从上述制备的文库中，在LA-Clm平板上铺满总共16,000CFU，使得获得单个菌落。通常将四个文库等分试样作为50μl等分试样分装到40-50LA-Clm平板上。
2. 在室温下孵育2天。
3. 通过加入1ml PBS /板来汇集Clm抗性菌落，并通过用L-spreader刮擦轻轻地分离集落。
4. 用移液管将PBS-悬浮液转移到50ml Falcon管中。
5. 从所有其他板集中殖民地，并将它们结合成一个50毫升管。轻轻地，但彻底地混合管。例如。通过脉冲涡流
6. 要准备汇集的转座子库以进行长期存储（即不立即使用的部分），请按照步骤8-10操作。
7. 继续分离肠炎小体抗性突变体遵循从步骤11向前的步骤。
8. 在4℃下，以3,000rpm（2,000xg）离心50ml管15分钟，小心地除去大部分上清液。
9. 将沉淀重悬于5ml TSP中的15％甘油中。
10. 将该库冻结成0.5ml等分试样并储存在-80℃。
11. 从合适的稀释液（f.ex. 1:100）测量合并的转座子文库的OD 600。
12. 基于结果，将细胞悬浮液用PBS稀释至OD 600〜0.2
13. 将10μlOD 600〜0.2悬浮液与10μl肠道粘蛋白混合（Strauch等人，2001）（合适的肠溶胆素剂量在VII部分中测定）和80μl μl的TSB
14. 将混合物铺在LA-Clm板上。
15. 重复步骤13-14四次，共5板。
16. 在室温孵育平板1-2天，以允许肠炎支原体抗性突变体的生长
17. 从板中取出单个菌落并作为纯培养物铺在新的LA-Clm板上。这些将构成候选肠球菌素抗性突变体。
18. 在室温下孵育平板1-2天。
19. 纯培养物的肠球菌组织抗性必须使用滴试验证实。将LA-Clm板分为8-12个部分，并使用接种环将培养突变体作为草坪的部分。作为对照，在某些部门培养已知的肠球菌敏感和抗性细菌
20. 立即，在每个草坪的中心，应用2微升enterocoliticin滴。
21. 在室温下孵育1-2天，并检查扇区
22. 他对肠道小杆菌素敏感的细菌在应用肠炎杆菌素的地方没有生长，而肠炎支原体抗性细菌在整个区域生长。
  继续第8节的肠炎支原体抗性突变体。
确定肠道凝胶溶液的杀伤电位
1. 使用新鲜的YeO3-R1殖民地接种15毫升管中的5毫升TSB。在室温下通气培养细胞过夜。
2. 测量培养物的OD 600。在PBS中稀释培养物至OD 600〜0.2。
3. 将10μl的OD 600〜0.2悬浮液与不同量的肠炎支原体溶液混合[Strauch et al。，2001]（f.1，5，10， 30和50μl）。使用TSB填充混合物的体积至100μl。
4. 将不同的混合物铺在单独的LA-Clm板上。
5. 在室温下孵育平板1-2天。
6. 计数自发抗性集落。应该有少于10个自发抗性菌落/板
鉴定转座子插入位点
Cat-Mu转座子插入位点可以通过对克隆到pUC19中的含转座子的基因组片段进行测序来鉴定（Pinta等人，2012）。
1. 为了克隆转座子插入片段，使用标准方案将HindIII消化的基因组DNA（使用适用于细菌的DNA分离试剂盒分离）克隆到HindIII消化的pUC19中。 HindIII不切割Cat-Mu，因此可以选择ClmR转化体。
2. 可以使用转座子特异性引物Muc1和Muc2（分别为5'-GCTCTCCCCGTGGAGGTAAT-3'和5'-TTCCGTCACAGGTATTTATTCGGT-3'）对从转化体分离的质粒中的插入片段进行测序。从这些序列获得允许鉴定转座子插入两侧的Cat-Mu侧翼区。

食谱

TGD缓冲区
10mM Tris-HCl（pH6.0） 0.5％甘油 0.1 mM DTT
5x复合缓冲液（10ml） 3,750μl2 M Tris-HCl（pH 6）
125μl10％Triton X-100 2,500μl3 M NaCl
10μl0.5M EDTA（pH8）
3,615μlddH 2 O 2/b 过滤灭菌（0.2μm）并分成等份可存储于-20年°C 一年
1 M DTT（20ml） 3.09克DTT
加入0.01M乙酸钠（NaAc），pH 5.2至最终体积过滤灭菌（0.2μm）并分成等份可在-20°C储存1年。
20％PEG6000（w/v）-2.5M NaCl（5ml） 1 g PEG6000
2.5ml 5M NaCl
将ddH2O加入最终体积。
过滤灭菌（0.2μm）并在同一天使用
SOB介质（1L），不含镁
20克细菌用胰蛋白胨 5克细菌 - 酵母提取物
0.584g NaCl
0.186克KCl
用5 M NaOH将pH调节至7.0 将ddH 2 O加入到最终体积并高压灭菌
在室温储存长达1个月
2 M Mg ++股
20.33g MgCl 2·6H 2 O
24.65g MgSO 4·7H 2 O
将ddH ₂ O添加到最终体积中。
过滤灭菌（0.2μm）或高压灭菌储存在4°C长达6个月
2 M葡萄糖（100ml）
26.04克葡萄糖将ddH ₂ O添加到最终量
过滤灭菌（0.2μm）
储存在4°C长达6个月
SOC培养基（100ml）
1ml 2M Mg ++储液
1 ml 2 M葡萄糖
98毫升不含镁的SOB培养基
Luria肉汤（LB）培养基（1L） 10克细菌用胰蛋白胨 5克细菌 - 酵母提取物
5克NaCl
用5 M NaOH将pH调节至7.0 将ddH 2 O加入到最终体积并高压灭菌
在室温储存长达1个月
LB琼脂（LA）平板（1L） 1 L LB培养基
15克细菌琼脂在高压灭菌前向LB培养基中加入Bacto琼脂
冷却至55°C
补充适当的抗生素和分配约。每个培养皿中加入20ml 储存于4°C长达1个月
氯霉素（Clm）溶液（10ml） 0.2克氯霉素
加入无水乙醇至最终体积
储备溶液（20mg/ml）可以在-20℃下储存1年
氯霉素以10μg/ml的终浓度使用
胰蛋白酶大豆培养基
根据制造商的指示进行准备
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（1L）
准备1 L 1×PBS如下。加入到800ml ddH 2 O 8中的8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na 2 HPO 4和0.24g 的KH 2 PO 4 4。用HCl调节pH至7.4。加入蒸馏水至总体积为1L。将溶液分成等份并通过高压灭菌（20分钟，121℃，液体循环）灭菌。储存在RT。
TAE缓冲区
2 M Tris-乙酸盐（pH 8.0）
50mM EDTA

致谢

该协议改编自我们先前发表的论文Pinta等人（2012）。这项工作得到了芬兰科学院（项目114075,104361和50441）的支持。和芬兰糖科学研究生院。我们感谢Eckhard Strauch博士提供在工作中使用的肠球菌肽。

参考文献

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