材料和试剂

拟南芥
玻璃幻灯片
镜片清洁纸（GE Healthcare，Whatman，目录号：2105-862）
牙签
双面胶带
牙科硅（乙烯基聚硅氧烷; VPS）印模材料：EXAFINE VPS印模材料注射型，粘度低（GC美国，目录号：138120）
注意：两个组分 - 基（A）和催化剂（B）。
高强度5分钟环氧胶（ITW Devcon，目录号：14210）
注意：两种组分 - 树脂（C）和硬化剂（D）。
用于眼科手术的超细线（Fine Science Tools，目录号：18020-03）

设备

镊子（精细科学工具，目录号：00108-11）
强制对流烤箱（YIHDER技术，型号：DK-600D）
立体显微镜（ZEISS，型号：Stemi DV4）
扫描电子显微镜（SEM;检查S，FEI）
溅射涂布机（EIKO Engineering，型号：IB-2）

软件

ImageJ软件（ http://rsb.info.nih.gov/ij）

程序

选择叶观察
1. 3至4周龄的成熟，完全扩张和平坦的拟南芥叶片。
2. 在处理后立即收集相同发育阶段的叶子使用。
  注意：如Therm等人先前所述的耐热测试（2017）。
3. 轻轻地彻底清除样品组织中的一块镜片清洁组织中的任何水分和任何其他表面污染物。
  注意：不要擦拭。
印模准备
1. 将硅印模材料施加在叶片的下表面（背面）上以获得负模具（图1A）。
铸造准备
1. 用环氧凝胶填充压模的顶部以制备铸件（图1B）。
SEM观察
1. 将铸件固定在金属短棒上，并在具有旋转台的自动溅射涂布机中用薄金钯（1：1）薄膜涂覆3分钟。
2. 按照SEM手册可视化演员表。

数据分析

所有图像均以TIFF格式保存，并使用ImageJ软件分析气孔。通过计算每单位叶面积的造口数确定气孔密度。测量气孔孔的宽度和长度。使用不同时间点每次处理三叶，每叶至少150个气孔进行统计分析（Huang et al。，2017）。请参见图2中的详细信息

图2.使用图像处理软件ImageJ测量气孔孔径图像分析的基本步骤正在逐步显示，用于分析SEM图像中的对象。步骤1.下载并运行ImageJ程序;步骤2.通过选择文件打开气孔图像，打开样品，然后单击确定;步骤3.对于图像处理：（a）将图像转换为8位灰阶模式，然后（b）裁剪图像的有意义部分（绘制矩形）。（c）在阈值设置之前，可以使用图像的锐化版本。（d）通过手动定义直方图来选择气孔的阈值新图像。（e）和（f）处理二进制以制作黑白图像。在此步骤中细化样品的形状。（g）可以为您感兴趣的对象确定粒度范围（最小大小和最大像素面积大小），因此排除图像中不感兴趣的任何内容。步骤4.结果窗口自动打开。

致谢

这里提出的方案是基于William和Green（1998）和Kwiatkowska和Burian（2014年）的以前的工作。作者非常感谢Chin-Ho Lin博士（国立中兴大学）对这种印象技术的有益建议，以及Lynne Stracovsky进行英语编辑。这项工作得到了台湾大学（101〜105R892003，105R89203）和台湾科技部（102-2311-B-002-031,103-2311-B-002-008和104-2311）的资助。 -B-002-007）到TLJ

参考

Gitz，DC和Baker，JT（2009）。将气孔曝光直接制成可归档幻灯片的方法。 Agron J 101：232-236。
Huang，YC，Wu，HC，Wang，YD，Liu，CH，Lin，CC，Luo，DL和Jinn，TL（2017）。 PECTIN METHYLESTERASE34通过其促进气孔运动的作用有助于耐热性。植物生理学174：748- 763.

Kwiatkowska，D.和Burian，A.（2014）。生长器官表面的体内成像的顺序复制物。方法Mol Biol 1080：99-110。

William，MH和Green，PB（1988）。顺序扫描电子生长中的植物分生组织的显微镜。原生质体 147：77-79。