材料和试剂

透射电子显微镜（TEM）
1. 具有铝盖帽的闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-340-4B）
  制造商：DWK Life Sciences，Kimble ®，目录号：7450320.
2. BEEM嵌入胶囊尺寸'00'（电子显微镜科学，目录号：70000-B）
3. Formfar碳膜200目Ni网格（电子显微镜科学，目录号：FCF200-Ni）
4. 铜200目网格（电子显微镜科学，目录号：EMS200-Cu）
5. 精子细胞
  1. Megaceros flagellaris
  2. > us us us us>>>。。。。
  4. 银杏叶
  5. Angiopteris evecta
  6. Conocephalum conicum
  7. Ceratopteris richardii
  9. > re re re>>>。。。。。。
6. 乙醇（Decon Labs，目录号：2705HC）
7. 低粘度树脂
8. 戊二醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：16120）
9. Sorensens磷酸盐缓冲液，0.2M，pH7.2（Electron Microscopy Sciences，目录号：11600-10）
10. 四氧化锇（Electron Microscopy Sciences，目录号：19150）
11. 亚铁氰化钾（Fisher Scientific，目录号：P236-500）
12. 乙酸铀酯（Polyscience，目录号：21447-25）
13. 100％甲醇
14. 硝酸铅（电子显微镜科学，目录号：17900）
15. 柠檬酸钠（电子显微镜科学，目录号：21140）
16. 1 N NaOH
17. 100％环氧丙烷（Electron Microscopy Sciences，目录号：20401）
18. 2.5％戊二醛（见食谱）
19. 0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见配方）
20. 4％四氧化锇水溶液（参见食谱）

设备

透射电子显微镜（TEM）
1. 钻石刀（Diatome，规格：Ultra，45°，4 mm，湿）
2. 透射电子显微镜（日立，型号：HF7100）

程序

透射电子显微镜（TEM）
TEM检查显示了植物精子的诊断发育特征和结构特征。说明这些植物特异性特征的三个实例在本文中表面描述：基础体起源（图1），运动器官发育（图2）和基础体/鞭毛结构（图3）。基底体的新生外观采取几种独特的形式，其中最着名的是双核生物和睑状体。苔藓植物和大多数lycophytes的精子细胞双歧杆菌，而在这些植物中，基底体起始于两端并列连接的中心粒（图1A）。 Centrioles在中心核心或集线器周围有9个重叠三重态微管的典型补体（图1B）。每个新生精子细胞都继承了一种二百里酵母，在发育过程中，两个中心粒分离，重新定位并成为双鞭配子中的基础体。在蕨类植物中，睑缘状体在精细细胞中形成。每个睑缘质体是球形的，并且包含将被组装在年轻精子细胞中的致密基质中的所有基体的中心轮毂（图1C）。
中心粒的另一种起源模式发生在具有多个鞭毛的两个lycophytes之一的Phylloglossum 中。在这种情况下，中心粒起源于中心轮毂的分支单元，三联体直接组装在该中心毂上（图1D）。 20个左右的基底体以这种方式形成分离，并且围绕着发育中的精子细胞的前部并排并进入鞭毛。在种子植物中，银杏叶中的一对大量眼睑毛细胞在电子致密单元周围组装大约1000厘沲，其中包含偶尔含有基体的球形电子透射区域（图1E）。苏铁生产类似于银杏的眼睑鳞状细胞，但要大得多，产生大约40,000-50,000个基底体（Gifford和Larson，1980）。

图1.精子细胞中基础体的起源。：一种。苔藓植物和大多数lycophytes的二百里香在这里代表了巨型鞭毛虫（Megaceros flagellaris），一种伏地草。它由两个由中心核心（箭头）端对端连接的中心线组成。 B. Ph inian a inian a a B. B. B. B.。。。。B. horn，，，，，。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 C.镰刀菌（Ceratopteris richardii）中所示的蕨类植物的睑缘质体包含嵌入非晶密集基质中的许多基体体心。 D.一种分枝的中心单位形成在具有大约20个鞭毛的两个淋巴细胞之一的Phylloglossum drummondii的精子细胞母细胞中。将三倍体微管直接装配在毂上，首先（箭头）和B和C微管产生一个微管。 E.银杏的精子母细胞中的大量眼睑细胞在电子致密单元周围具有约1,000个中心粒子，其中包含偶尔含有基体（箭头）的球形电子透射区域。棒=0.2μm（A，C，D），0.1μm（B），1.0μm（E）
在新生精子细胞中，基体随着其他器官的发育而分离和迁移。这种重新定位通常与致密的微管组织中心相关联，许多微管从该中心发出（图2A）。在蕨类植物中，基本体被组装在中心轮毂周围，因为加入三联体的A，B和C微管（图2B）。然后，短基础体与由层状条和微管带组成的多层结构（图2C）一起迁移，直到它们以精确的布置定位在细胞的前线圈周围（图2D）。在重新定位时，基底体从两端开始伸长。在近端，添加更多的三联体以延长基底体，并且在蕨类植物中，轮毂形成高度伸长的延伸，其是短暂的并且在晚期精子中消失（图2E）。包含星状构型的过渡区（图2E）在基体重新定位期间开始形成（图2D）。

图2.微管组织中心和精子细胞（发育精子细胞）中的运动器官的发展。：一种。密集的微管组织中心（MTOC）具有发出的微管（*）和三个基础体，在"Phylloglossum drummondii"中。 MTOC指导基体放置。 B.在Ceratopteris richardii的精子细胞中，在横截面（左箭头）和纵向截面（右箭头）中看到的短基底体在电子致密基质中发展和重组。 C.基层体重组C. richardii 与由层状带和微管带组成的多层结构（mls）的发展同步发生。 D.在前运动器械的组装过程中，C的基体。 richardii 从两端生长，导致整齐排列的细长基底体;具有星状图案（sp）的后过渡区域在这些基体中开始延长。 E. fl is f ern fl after after after f f f f f f f f。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。延伸是短暂的，因此在成熟的配子中是缺乏的。过渡区域中的基底体（bb）和星状图案（sp）位于从细胞体（箭头）出现的鞭毛的内部。棒=0.2μm（A-E）。

近端基体延长对于定位基础体在苔藓和具有两个二形交错基底体的肝脏精液中是至关重要的（图3A-3C）。通过在一个基底体中通常三个腹侧三联体的近端伸长来实现交错，其变得非常长（图3A），并且最终锚定在距离较不细长的前基底部一定距离处。前基底体中背侧三联体的轻微近端延伸将其固定在多层结构内（图3B）。苔藓配子发育的一个独特特征是存在从微管带流出的单个微管，并且似乎在后基底体伸长期间将腹侧三联体引导到位（图3C）。

图3.成熟基底体和鞭毛的结构 A.多发性心脏的后基底体，简单的沙拉鱼肝，由细长的腹侧三联体（箭头）和轮毂h）远远超出原始基体（bb）。 B.双锥体基底体，一种复杂的沙门氏菌，横截面。多层结构（mls）对着右侧的前基底体，其中包括轮毂和六个三线制延伸部和左侧的后基底体，其仅由三个腹侧三联体延伸部分组成。 C.麝香的后基底体，如ium re re re，，，，，，，，，and and and and and and and and and。。。。。by（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（在这个横截面中可以看出，右侧的前鞭毛只在多层结构的微管带外面。 D.Leophophyte Phylloglossum中的基底体和鞭毛的纵剖面，示出了对应于从右到左的横截面的基体（F1），过渡区（F2）和鞭毛（F3） Equisetum 中的F图。值得注意的是，过渡区的星状图案位于细胞体的鞭毛出现之前和之后（箭头）。 E.过渡区域的星状图案的两个基底体的横断面以及fl叶中的两个鞭毛。仍然包含在细胞体中的星状图案（左箭头）由九个重叠的三联体组成，并且位于鞭毛轴（右箭头）中的星形图案（左箭头）具有与单个中心微管的九个重叠的双峰。 F.图D中F1，F2和F3表示的基础体，星状图和轴突的横截面。G.镰刀菌中的鞭毛的横截面证明了陆地植物轴突的典型的9 + 2构型。棒=0.2μm（A-F）。

注意：对于下面的每个溶液变化，通过加入溶液完全饱和组织，直到其上升到小瓶/管中的材料上（这可以是1ml至5ml（或更多种）溶液的任何位置，这取决于多少组织在每个管或小瓶中）
1. 如果在0.05M磷酸钠缓冲液（pH7.2）中的2.5％过氧化物中，固定植物组织（如果非常小的切割或全配子体，例如蕨类蕨类配子体）。
2. 在0.05M磷酸缓冲液（pH 7.2）中冲洗三次（每次15分钟）。
3. 在2％四氧化锇（1.5％的亚铁氰化钾）中，室温下固定2小时。
4. 在双蒸蒸压灭菌水（每次10分钟）中冲洗三次，通过25％，50％，75％和95％乙醇脱水（每次20分钟），在100％乙醇（每次20分钟）中漂洗两次，然后冲洗三次在100％环氧丙烷中（每次15分钟）
5. 在4℃下，在低粘度树脂（用环氧丙烷稀释）中浸泡25％，50％和75％12小时，浸泡3次纯树脂8小时。
6. 每个BEEM包埋胶囊放置一个或两个花药（取决于大小），并在60℃下在烘箱中聚合48小时。
7. 用金刚石切割金/银切片，并使用槽（1 x 2 mm）或200目铜网格收集在任何一种形状的胶片上。
8. 用2％乙酸铀酰（2分钟）后染色，然后加入碱性柠檬酸铅（5分钟），然后在日立HF7100中观察。

食谱

0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）
加入5份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至95份双蒸高压灭菌水
0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）
加入25份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至75份双蒸压灭菌水
2.5％戊二醛
1. 将1份10％戊二醛加入1份双蒸煮蒸压水中
2. 将1份0.20 M Sorensen磷酸盐缓冲液（pH 7.2）加入1份双蒸压蒸煮水中
3. 加入1份5％戊二醛至1份0.10M索伦森磷酸缓冲液（pH7.2）
0.05 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）
加入1份0.30 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）至6份双蒸压蒸煮水
2％四氧化锇水溶液
将1份4％四氧化锇水溶液加入1份双蒸精制高压灭菌水中
0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）
加入1份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至10份双蒸压灭菌水
0.05 M PIPES缓冲液（pH 7.2）
将1份0.30 M PIPES缓冲液（pH 7.2）加入6份双蒸煮蒸压水中
1.5％亚铁氰化钾
加入1.5克亚铁氰化钾至10ml双蒸高压灭菌水中
2％乙酸铀酰
加入2g乙酸双氧铀至10ml双蒸高压灭菌水或100％甲醇
雷诺的柠檬酸铅
1. 将1.33克硝酸铅和1.76克柠檬酸钠加入到已冷却至室温并摇动30分钟的30毫升煮沸的双蒸煮高压灭菌水中。
2. 加入8 ml 1N NaOH
3. 加入12毫升双蒸高压灭菌水

致谢

这项研究得到了国家科学基金资助的研究资助（DEB-0322664，DEB-0423625，DEB0521177和DEB-0228679）的支持，作为本科生研究经验和组装生命之树计划的一部分。

参考

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