材料和试剂

移液器提示（美国科学）
100毫米培养皿
50ml Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
尼龙活检袋（Electron Microscopy Sciences，目录号：62324-35）
MicroAmp光学96孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：N8010560）
基质血管细胞（SVCs）
70％乙醇
稳定固定缓冲液（BD，BD Biosciences，目录号：339860）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
2％胎牛血清（FBS）
抗体

兔单克隆抗GAPDH（Cell Signaling Technology，目录号：5174）
兔单克隆抗磷酸化NF-κBp65（Cell Signaling Technology，目录号：3033）
PE-Cyanine7抗鼠F4 / 80（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：25-4801-82）
Alexa Fluor 488抗小鼠CD11b（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：53-0112-82）
APC抗小鼠CD11c（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：17-0114-82）
PE抗小鼠CD206（BioLegend，目录号：141706）
eVolve-605抗小鼠CD45（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：83-0451-42）
APC抗小鼠CD19（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：17-0193-82）

Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15596026）
Direct-zol RNA试剂盒（Zymo Research，目录号：R2070）
高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4368813）
qPCR引物（表1）

表1. qPCR引用信息
SYBR Green PCR Master混合物（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4309155）
Hanks的平衡盐溶液（HEPES）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630080）
胶原酶II（Sigma-Aldrich，目录号：C1764-50MG）
牛血清白蛋白（BSA）
氯化铵（NH 4 Cl）
碳酸氢钾（KHCO 3 ）
5％EDTA
叠氮化钠（NaN 3 3）
Iscove修改的Dulbecco's Medium（IMDM）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号15140122）
消化缓冲液（参见食谱）
红细胞裂解缓冲液（见配方）
FACS染色缓冲液（参见食谱）
完整的培养基（参见食谱）

设备

移液器
砂浆和杵
弯曲剪刀
新不伦瑞克科学12400培养箱振荡器（Eppendorf，型号：New Brunswick TM 124）
Eppendorf离心机5810R（Eppendorf，型号：5810 R）
TC20自动细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，型号：TC20 TM，目录号：1450102）
BD FACSCanto流式细胞分析仪
StepOnePlus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：StepOnePlus TM，目录号：4376600）
DNA引擎Peltier热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：PTC-200）
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 1000）

软件

FlowJo
GraphPad Prism

程序

从脂肪组织分离基质血管细胞（SVC）（图1）

图1.从脂肪组织分离基质血管细胞的方案
1. 18岁至20岁的雄性小鼠按照ICCUAC批准方案进行安乐死。
2. 用70％乙醇彻底润湿毛皮，然后打开胸腔，收集附睾脂肪组织称重。
3. 使用弯曲剪刀在100毫米培养皿上煎炸脂肪组织。
4. 将切碎的组织转移到含有消化缓冲液（含有2％BSA和100mM HEPES的HBSS）的50ml Falcon管中。
5. 每1g脂肪组织加入10 ml消化缓冲液（参见食谱）。
6. 在孵化器振荡器（水平固定管）中孵育10分钟，37℃（无组织组织代表完全消化）。
7. 加入等体积的完整培养基并混合以停止消化。
8. 通过尼龙活检袋（孔径= 250μm）过滤到新的50ml Falcon管中
9. 在4℃下以1500×g离心10分钟。
10. 倾析上清液，并将细胞沉淀重新悬浮于1ml PBS / 2％FBS中
11. 加入2毫升红细胞裂解缓冲液（参见食谱）（1：2）并混合
12. 在冰上孵育10分钟。
13. 加入3毫升完整培养基（1：1）并混合
14. 以1,000 x g离心5分钟，4°C。
15. 倾倒上清液。
16. 将SVC用0.5ml PBS / 2％FBS再悬浮，然后使用TC20自动细胞计数器计数。细胞浓度调整至每毫升2×10 6个细胞，细胞准备进行下游实验。
流式细胞仪分析
1. 准备0.5-1×10 6个SVC并重悬于FACS染色缓冲液（参见食谱）。
2. 按照制造商的指示，用荧光偶联抗体（Materials and Reagents＃11）染色SVC。
3. 在室温下孵育15分钟（光敏;保持在黑暗中）
4. 加入1ml FACS染色缓冲液
5. 以1,000×g离心5分钟，4℃。
6. 倾倒上清液。
7. 用100-200μlFACS染色缓冲液重新悬浮。
  选项：细胞可以在4℃下在BD TM 稳定固定缓冲液中储存3天，然后用于FACS分析。
8. 然后样品准备好进行流式细胞分析（图2）或细胞分选仪的特异性免疫细胞分离。
  
  图2.内脏脂肪组织免疫细胞的流式细胞术分析（VAT）。将SVC用针对CD11b，F4 / 80，CD11c，CD206，CD19的荧光结合抗体染色，然后通过流式细胞术分析进行检查。 A.脂肪组织巨噬细胞（ATM）定义为CD11b + / F4 / 80 + 亚群，并显示为CD45 + 细胞的百分比。 B.M1和M2 ATM被定义为CD11b F4 / 80 + CD11c + CD206 - 和CD11b 分别为CD206 CD206 + 。这些细胞群体显示为ATM的百分比。 C.B细胞被定义为CD45 CD19 + ，细胞群以CD45 +细胞的百分比表示。
RT-PCR
1. 将SVC重新悬浮于Trizol中（加入100μlTrizol试剂至<10μg细胞;加入300μlTrizol试剂至<10μg/ ml细胞）中，并在室温（RT）。
2. 在1000×g离心5分钟（RT）后，将上清液转移到新管中。
3. 使用Direct-zol RNA试剂盒分离总RNA
4. RNA浓度用NanoDrop 1000分光光度计测定
5. 使用高容量cDNA逆转录试剂盒将RNA（500ng）转化为cDNA
6. 逆转录反应在热循环程序下：25℃10分钟，然后37℃120分钟，然后85℃5分钟，然后4℃。
7. cDNA在MicroAmp Optical 96孔反应板中是混合引物和SYBR Green PCR Master Mix
8. 实时PCR（qPCR）反应在热循环条件下运行：95℃10分钟，然后40次循环（95℃15秒，然后60℃1分钟）。
9. RT-PCR结果显示，贫血SVC表现出比肥胖SVC更高的精氨酸酶1表达，但较少的TNFα丰度（图3A和3B）。
  
  图3.通过RT-PCR分析和Western印迹的SVC的炎症状态。精氨酸酶1（A）较少，但更多的TNFα（B ）肥胖SVCs的丰度，与瘦SVC相比（qPCR引物信息见表1）。 C.通过蛋白质印迹分析（抗体信息参见材料和试剂＃11）评价SVC的NF-κB信号通路的激活（无刺激）。数据以平均值±SEM表示。每组n = 3。 ** 0.01，*** 0.001，Student's t -test。
Western印迹
参见2011年Zhang的前一篇文章。蛋白质印迹分析表明，肥胖SVC的磷酸化P65水平高于贫血SVC（图3C）。

食谱

消化缓冲液（新鲜制备），50 ml
50ml HBSS
50毫克胶原酶II
100毫克BSA
100 mM HEPES
红血细胞裂解缓冲液（10x），1L
PBS（不含钙和镁）
8.3g氯化铵（NH 4 Cl）（150mM）
1.0g碳酸氢钾（KHCO 3）（10mM）
1.8ml 5％EDTA（0.1mM）
FACS染色缓冲液，100 ml
98毫升PBS（不含钙和镁）
2 ml FBS
0.1g NaN 3
完成培养基
500毫升Iscove修改的Dulbecco的介质（IMDM）
50ml FBS
5 ml青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific）

致谢

这个协议是由Ying等人（2017）进行的。本研究由美国心脏病协会（W.PeiT31350039，W. Ying）资助，中国国家自然科学基金（81600610）。

参考

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