材料和试剂

移液器提示（Tarsons products pvt ltd。，India）
微量离心管（Tarsons products pvt ltd。，India）
培养皿（Genaxy science pvt ltd。，印度）
无菌牙签
酵母酿酒酵母菌株：74D-694（MATa ade1-14，his3-200，ura3-52，leu2-3,112，trp1-289，[ psi - ]）
注意：该测定还可以使用携带突变体酵母或ade2Δ突变酵母的ade2-1等位基因以及使用ade1Δ突变体酵母进行。
质粒

pRS416-GAL1p-FUS-YFP（URA3）（Addgene，目录号：29593）
pRS416-GAL1p-TDP43-YFP（URA3）（Addgene，目录号：27447）
pRS416（URA3）
pAG416 GAL1p-ccdB-EGFP（URA3）（Addgene，目录号：14195）

0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）
2'，7'-二氟荧光素二乙酸酯[DCFDA]（Sigma-Aldrich，目录号：D6883）
乙酸锂（Sigma-Aldrich，目录号：517992）
胨（HiMedia Laboratories，目录号：RM001）
D-葡萄糖[葡萄糖]（AMRESCO，目录号：0188）
酵母提取物（HiMedia Laboratories，目录号：RM027）
细菌琼脂（HiMedia Laboratories，目录号：RM026）
D-棉子糖（Sigma-Aldrich，目录号：83400）
D-半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：48260）
酵母氮基（HiMedia Laboratories，目录号：G090）
十二烷基硫酸钠[SDS]（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：372978）
硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A2939）
氨基酸：精氨酸，组氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，腺嘌呤，苯丙氨酸和酪氨酸（HiMedia Laboratories，India）;亮氨酸和色氨酸（Sigma-Aldrich，USA）
YPD培养基（见食谱）
SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP板（参见食谱）
SRaf-Ura肉汤（见食谱）
SD-Ura +¼YP板（参见食谱）
SD-Ura + 1/3的平板（参见食谱）
DCF提取缓冲液（见配方）

设备

移液器（康宁，美国）
250毫升锥形瓶（Borosil Glass Works ltd。，印度）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：MicroCL 21R）
荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM2500）
层流生物安全柜（Esco Micro，型号：ACB-4A1）
温度控制孵化器（JS研究，型号：JSGI-100T）
温控轨道摇床（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Excella ® E24）
UV-Vis分光光度计（日立高科技，型号：U-3900）
涡街搅拌机（Remi，型号：CM-101）
高压灭菌器（JS研究，型号：JSAC-100）
多模微板读数器（Molecular Devices，型号：Spectramax M5e）
相机

软件

GraphPad QuickCalcs软件（来自GraphPad Software Inc.，USA）
https://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm < / a>

程序

具有ade1-14等位基因的酵母细胞（或具有ade1Δ或ade2Δ或ade2的Ema细胞 > 1 等位基因）用编码淀粉样蛋白形成蛋白的标记的半乳糖诱导型GAL1启动子驱动的质粒预先转化（例如：TDP-43-YFP或FUS-YFP）。将这些细胞扩散在质粒选择性SD-Ura +¼YP平板上（参见食谱），并在30℃温育4-5天以获得独立的单个菌落。请注意，在介质中存在¼YP即使在辍学介质上也可以进行红色菌落颜色显影，否则通常在YPD培养基上得分（参见食谱）。
随后，挑选出来自SD-Ura +¼YP板（图1A）的单个酵母菌落的红色表型，并在保持在200rpm和30℃的振荡培养箱中在5ml SRaf-Ura肉汤中生长过夜以克服葡萄糖镇压

图1.淀粉样蛋白诱导的氧化应激在S中的测定。酿酒酵母模型。：一种。具有74-D694 [...]的红色表型将酵母酿酒酵母细胞用空白载体质粒pRS416或编码EGFP，TDP-43-YFP或由GAL1启动子驱动的FUS-YFP蛋白的那些。用2％半乳糖诱导这些蛋白质的过度表达，然后将细胞接种在SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP平板上以获得单个菌落。所有获得的空载体和EGFP表达细胞的菌落都是红色的，而表达17％FUS-YFP的菌落和100％TDP-43-YFP表达菌落显示白色表型。使用智能手机相机拍摄图像（13 MP）。将显示从FUS-YFP获得的菌落的白色表型和SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP板上的TDP-43-YFP表达依次传代为SD-Ura +¼YP平板上的贴片。第三次传代后，发现携带TDP-43-YFP质粒的斑块变红。然而，即使在SD-Ura +¼YP板上三次传代之后，FUS-YFP质粒携带细胞的白色斑块也保持白色，但在SD-Ura + 1 / YP平板上迅速变红。来自TDP-43-YFP和FUS-YFP的白色斑块即使在含有YPD平板的富含复合培养基上的第一次通过后也转变为红色表型。来自空载体或EGFP表达的质粒转化体的片段在SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP，SD-Ura +¼YP，SD-Ura + 1/3的YP以及YPD平板上保持红色。使用智能手机相机拍摄图像（13 MP）。使用DCFDA测定（Eruslanov和Kusmartsev，2010; James et al。，2015）检查了表现酵母转化体的红色和白色表型之间的相对ROS水平。与TDP相比，来自TDP-43-YFP白色斑块的酵母细胞（从SD-Ura +¼YP上的第一次传代）产生DCF荧光的统计学显着性差异[P = 0.0148，n = 3] -43-YFP红色斑块（来自SD-Ura +¼YP板上的第三代）表明白色斑块中较高的ROS。同样地，当来自图1A的FUS-YFP表达的白色和红色菌落被传代一次作为SD-Ura +¼YP平板上的斑块（仍然保留其相应的原始表型），然后测定ROS水平时，白色斑块产生统计学显着性与红色斑块相比，较高的DCF荧光[ P = 0.0133，n = 3]如所预期的，与用空载体转化的细胞相比，来自TDP-43-YFP或FUS-YFP表达细胞的白色斑块的DCF荧光水平也显着高于用<！ - SIPO < 3; P = 0.0031，n = 3]。在所有情况下，使用非配对t检验进行统计比较。
第二天早晨，将来自过夜培养物的合适的酵母细胞等分试样接种到5ml新鲜SRaf-Ura肉汤中以获得A 600nm±0.2的起始OD，并用2％半乳糖终浓度诱导过表达GAL1启动子驱动的基因，然后在30℃下生长8小时用于表达FUS-YFP或TDP-43-YFP蛋白（或直到观察到淀粉样蛋白聚集，其可以不同的淀粉样蛋白不同）。通过在荧光显微镜下检查酵母细胞以形成FUS-YFP或TDP-43-YFP蛋白质的点状荧光病灶来评估淀粉样样聚集。
接下来，通过在25℃下在台式微量离心机中以3,000xg离心收获细胞，并重新悬浮于无菌水中，然后在记录A 600nm后进行适当稀释， sub>在分光光度计中，每片平板上扩散约200个细胞至SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP平板（参见食谱）（1 OD 600nm 1 = 10×10 7 细胞/ ml）。然后将板在30℃温育4-5天以培养单个酵母菌落。
四天后，使用2％半乳糖（TDP-43-YFP和FUS-YFP），通过使用2％半乳糖（TDP-43-YFP和FUS-YFP）预先过表达诱导的氧化应激，检查培养板的菌落颜色和白色菌落的出现（步骤3 ）和SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP平板上的淀粉样蛋白的连续中度表达（步骤4）（图1A）。请注意，获得的白色菌落的百分比可能因不同的淀粉样蛋白而异。当表达TDP-43-YFP时，观察到100％的白色菌落，而对于FUS-YFP，只有17％的菌落是白色的，剩余的是红色的。在对照组（仅携带空载体质粒或任何非淀粉样蛋白质表达质粒如EGFP）中，仅在SRaf-Ura + 0.1％gal + 1 YP板上观察到红色菌落，因为淀粉样蛋白诱导的氧化应激不存在。 />
接下来，使用无菌牙签，将来自SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP板上的白色菌落的少量细胞修补到SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP，SD-Ura +¼YP和YPD平板。酵母细胞在SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP和SD-Ura +¼YP板上继续看起来白色，但在YPD平板上变红（图1B）。
注意：传递时不需要对单元格进行规范化。
随后，将来自白色斑块的细胞从SD-Ura +¼YP平板顺序传代到作为斑块的相同的SD-Ura +¼YP培养基板上，以观察酵母颜色从白色变为红色。这表明在没有蛋白质表达和聚集体形成的情况下，酵母细胞中的氧化应激逐渐停止并导致白色至红色的切换。请注意，获得红色表型所需的添加YP量可能因不同的淀粉样蛋白而异。例如，在SD-Ura +¼YP板上三次传代之后，TDP-43-YFP的白色菌落变成红色，而FUS-YFP的白色菌落需要在SD-Ura + 1 / YP板上额外通过（参见食谱）转化为红色表型（图1B）
为了确定白色转换确实是由于氧化应激，随后分析了活性氧（ROS）的存在。为了对白色和红色菌落的ROS水平进行定量，首先用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4，温度25℃）将来自平板（或甚至来自相同液体培养液）的酵母细胞洗涤两次，离心在25℃下在台式微量离心机中重新悬浮在450μl磷酸盐缓冲液中。然后向该细胞悬浮液中加入50μl2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染料，从100μM储备液（储存在-20℃）中得到10μM最终的DCFDA，然后在黑暗中孵育30 min。然后，将细胞在25℃下以3,000×g离心5分钟。
将所得颗粒重新悬浮于500μl的2M乙酸锂（温度25℃）中，并在涡旋混合器上轻轻搅拌2分钟。然后通过在25℃下以3,000×g离心5分钟使细胞沉淀。接下来，通过将细胞重新悬浮在500μlDCF提取缓冲液（参见食谱）中并且剧烈搅拌2分钟，从细胞中提取由细胞酯酶切割DCFDA而后被细胞ROS氧化产生的DCF分子在涡旋混合器上。最后，将样品在25℃下以3,000×g离心5分钟，并将300μl上清液用于DCF荧光测量。
使用Spectramax M5e多模微板读数器记录DCF荧光，通过在485nm下激发后在524nm处记录发射（Eruslanov和Kusmartsev，2010; James等人，2015）。通过比较类似和同时测定的适当对照样品的DCF荧光来比较升高的ROS水平的存在（图1C）。

数据分析

DCF荧光用于表现酵母细胞的红色与白色表型中的相对ROS水平测定。为了比较FUS-YFP或TDP-43-YFP表达后红色和白色酵母细胞之间观察到的DCF荧光（因此相对ROS水平）的统计学显着性，来自三个独立的红色和白色表型集落的数据，并且通过使用GraphPad QuickCalcs软件（来自GraphPad Software Inc.，USA）的非配对测试获得 P 值。

笔记

DCFDA测定应始终在黑暗中进行，琥珀色的小瓶应用于储存溶液，因为DCFDA对光敏感，并且在直接曝光时可以自动氧化。

食谱

YPD板（100毫升）
2克蛋白胨
2 g葡萄糖
1克酵母提取物
2 g琼脂
SRaf-Ura + 0.1％gal +¼YP板（100ml）
0.7克酵母氮碱与硫酸铵和氨基酸但缺乏尿嘧啶
1克棉子糖
0.1克半乳糖
0.5克蛋白胨
0.25克酵母提取物
2 g琼脂
SRaf-Ura肉汤（100毫升）
0.7克酵母氮碱与硫酸铵和氨基酸但缺乏尿嘧啶
1克棉子糖
SD-Ura +¼YP板（100 ml）
0.7克酵母氮碱与硫酸铵和氨基酸但缺乏尿嘧啶
2 g葡萄糖
0.5克蛋白胨
0.25克酵母提取物
2 g琼脂
SD-Ura + 1/3的板（100毫升）
0.7克酵母氮碱与硫酸铵和氨基酸但缺乏尿嘧啶
2 g葡萄糖
0.66克蛋白胨
0.33克酵母提取物
2 g琼脂
DCF提取缓冲液
5μl10％SDS
5毫升无菌蒸馏水
100μl氯仿

致谢

这个协议是从我们原来的手稿改编为Bharathi等人。（2016）。感谢美国内华达里诺大学的Susan Liebman教授用于酵母菌株和质粒。我们感谢由印度政府MHRD资助的IIT海得拉巴用于消耗性支持和研究基础设施。印度政府DBT的Vidhya Bharathi初级研究奖学金和印度政府MHRD的Amandeep Girdhar高级研究奖学金也得到了正式的承认。

参考

Bharathi，V.，Girdhar，A.，Prasad，A.，Verma，M.，Taneja，V.and Patel，BK（2016）。＆nbsp; 使用 ade1 和 ade2 突变，用于开发多功能红/白色测定淀粉样蛋白诱导的酿酒酵母中的氧化应激酵母 33：607-620。

Chernoff，YO，Derkach，IL和Inge-Vechtomov，SG（1993）。多重拷贝SUP35 基因在酵母酿酒酵母中诱导了psi样因子的脱钙出现。 > 24（3）：268-270。

Eruslanov，E.和Kusmartsev，S.（2010）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-60761-411-1 “target =”_ blank“>氧化应激的高级方案II。在：Armstrong，D.（Ed。）。人文出版社 57-72。

James，J.，斐济，N.，Roy，D.，Andrew，MG。 D.，Shihabudeen，MS，Chattopadhyay，D.和Thirumurugan，K.（2015）。＆nbsp; 使用H 2 DCF-DA评估酵母中的活性氧物质的快速方法分析方法 7：8572-8575。

Rossi，S.，Cozzolino。 M.和Carri，MT（2016）。＆nbsp; 旧与ALS发病机制中的新机制相比较。脑部Pathol 26：276-286。

Sharma，KG，Kaur，R。和Bachhawat，AK（2003）。酵母中的谷胱甘肽介导的解毒途径：使用积累在酵母的某些腺嘌呤生物合成突变体中的红色素的分析揭示了新基因的参与。 180微量元素 180 2）：108-117。