材料和试剂

NaOH（NaOH颗粒）
具有ThermoPol缓冲液的Taq DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0267X *，M0267L或M0267S）
*注意：在4,000U时，〜800μl的Taq提供几千个PCR反应。缓冲液成为限制性试剂。 ThermoPol缓冲液配方可在NEB网站获得。该缓冲液可以与NEB（New England Biolabs，目录号：B9004S）分开订购，
引物长度推荐为18-21bp，具有高于56℃和约58℃的解链温度，并产生150-600bp的扩增子。
DNA加载缓冲液
推荐Orange G（Sigma-Aldrich，目录号：O3756）代替溴酚蓝用于加载染料
DNA梯度范围为100-800 bp范围
推荐1 kb Plus DNA ladder（Life Technologies，产品编号：10787-018）
琼脂糖
EtBr（Sigma-Aldrich，目录号：E8751）或SYBR Safe DNA Gel Stain（Life Technologies，目录号：S33102）
NaOAc
EtOH
苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）（不要使用酸性苯酚）
50mM NaOH在dH 2 O中（见配方）
10 mM dNTP Mix（见配方）
1x TAE缓冲区（请参阅配方）
dNTP集合A，C，G，T各100mM（GE Life Sciences，目录号：28406552）（参见配方）
0.3M NaOAc的ddH 2 O（参见配方）

设备

PCR热循环仪（96孔容量优选）
离心机（微型PCR管和微量离心机1.5ml管）
Liberty 1无缓冲高速凝胶系统（Neuvitro，6Mgel-SYS-LBT1）
Liberty 1，12通道移液器兼容13牙梳（Neuvitro，6Mgel - CMS-1315）
多通道移液器2-20μl
重复移液器10-125μl
带帽的PCR管，8或12个PCR条带管或96孔PCR板

程序

用于基因分型的摘取组织
注意：此协议同时使用12条PCR管对1-48个样品进行。条带PCR管允许使用多通道移液管来转移溶液。也可以使用96个PCR板。
1. 组织消化：
第二部分。 PCR反应和凝胶电泳
1. 组织消化后PCR：
  1. PCR主混合设置。
    注意：始终要比所需更多的反应。对于每12个样品，使2个样品额外，例如。对于48个样品，使主混合物共56个反应。
    每个反应：
    20μl·dH 2 O
    2.5μl - 10x ThermoPol缓冲液
    0.5μl - 10 mM dNTPs
    0.5μl-10μM引物混合物
    0.1μl - Taq DNA聚合酶
    总共23.6微升
  2. 在室温下将24μl主混合物等分到新的PCR管中。
  3. 从含有消化组织（Part I）的PCR管中转移2μlDNA到含有PCR主混合物等分试样的PCR管中。
  4. 短暂旋转。
  5. 样品可以保持在4℃，直到PCR机器可用当天。
  6. PCR程序
    1. 95 - 2分钟
    2. 95 - 30秒
    3. 56 - 30秒
    4. 72 - 30秒
    5. 重复步骤ii，iii，iv 34x
    6. 72 - 1分钟
    7. 10 - 5分钟
      END - 完全反应可以在室温下保存，直到准备进行凝胶电泳提示：不要修改PCR反应或程序。而是设计所有引物在相同的反应条件下是合适的。这样，您可以同时使用不同的引物运行多个PCR。这种方法已经用于对含有多个转基因和背景回交的小鼠进行基因分型^1,2。
2. 6分钟凝胶电泳
  1. 在自由1装置中使用EtBr或SYBR DNA凝胶染色法进行2％琼脂糖凝胶（使用4×13孔梳子以能够装载48个样品和DNA梯）。
  2. 向每个PCR样品中加入5μlDNA上样缓冲液。
  3. 通过上下吹吸混合。
  4. 在2％琼脂糖凝胶中转移15μl至12孔/泳道。
  5. 加入DNA梯子加载缓冲液到第13孔。
  6. 在200-220V下进行凝胶电泳6分钟。
  7. 使用适当的凝胶观察器或成像仪器来识别条带
第三部分。纯化基因组DNA并随后使用
1. 你可以通过各种方式净化DNA从第一部分的消化。两个列出：
  1. 沉淀DNA（适用于引物测序反应或半定量PCR的粗纯化）。
    1. 允许debri在第一部分消化程序后结算。
    2. 将顶部50μl的溶液转移到1.5 ml管中。避免拾起debri。
    3. 加入50μl的0.3M NaOAc在dH 2 O中，通过轻弹管混合。
    4. 加入300微升100％乙醇，通过轻弹管混合。
    5. 在-80℃下孵育3分钟。
    6. 以16,000×g离心3分钟。
    7. 干沉淀并重悬于50μldH 2 O或优选缓冲液中。
    8. DNA浓度现在可以通过分光光度法评估。
  2. 苯酚/氯仿DNA纯化（严格纯化）
    1. 允许debri在第一部分消化程序后结算。
    2. 将50μl溶液转移到1.5ml管中。避免拾起debri。
    3. 加入150μl的0.3M NaOAc在dH 2 O中，通过轻弹管混合。
    4. 加入200微升苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），摇动管。
    5. 以16,000×g离心5分钟。
    6. 转移150微升的上阶段到新的1.5毫升管。
    7. 加入450μl的100％EtOH。
    8. 将管置于-80℃3分钟。
    9. 以16,000×g离心3分钟。
    10. 除去上清液，不干扰沉淀。
    11. 加入1ml 75％EtOH并摇动管。
    12. 以16,000×g离心3分钟。
    13. 干沉淀并重悬于50μldH 2 O或优选缓冲液中。
    14. DNA浓度现在可以通过分光光度法评估。
2. 纯化的DNA可用于通过半定量PCR测定纯合子和杂合子小鼠注意：如果没有选择性引物，这种方法将增加鉴定基因的纯合小鼠的机会。该方法用于选择纯合子亲本小鼠用于含有四环素反式激活蛋白或黄色荧光蛋白的转基因。
  1. 2μl的0.05μgμl^-1 DNA可用于上述PCR反应，PCR程序循环数调整为19-23x，推荐21倍。
    提示：PCR循环数应该优化为给定引物组的正带可以正确地看到已知的杂合样品。
  2. 在凝胶运行和成像之后，可以通过眼睛或软件（例如ImageJ）比较条带强度的差异。
  注意：如果小鼠对于基因是纯合的，则PCR带将比来自与基因杂合的小鼠的样品更亮。提示：使用用于基因组中天然基因的引物的PCR反应可以用作

食谱

50mM NaOH，在dH 2 O中注意：NaOH（碱液）溶液是苛性碱！处理时戴上手套。
10 mM dNTP Mix
推荐从dNTP制备混合物设置100 mM每个A，C，G，T
10μM引物混合物
1x TAE缓冲区
0.3M NaOAc在ddH 2 O中

致谢

该协议改编自以前的工作（Lopez等人，2011; Lopez等人，2012年）。

参考文献

Lopez，M.E.，Klein，A.D.，Dimbil，U.J.and Scott，M.P。（2011）。解剖定义的基于神经元的神经退行性尼古丁选择C型疾病的救援 J Neurosci 31（12）：4367-4378。
Lopez，M.E.，Klein，A.D.，Hong，J.，Dimbil，U.J.and Scott，M.P。（2012）。神经元和上皮细胞拯救解决了脂质储存障碍中的慢性全身炎症Niemann-Pick C。 a> Hum Mol Genet 21（13）：2946-2960。