材料和试剂

移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：T-300-R-S）
一次性纸巾（Vinda Classic Blue 1800，Vinda，目录号：V4028）
24孔细胞培养板（Corning，Costar ®，目录号：3524）
无菌牙签
微管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
医用纱布（普通棉纱，上海虹龙医疗材料公司）
医用级吸收棉（上海宏隆医疗材料公司）
搪瓷盘（20x 30 x 5厘米）
玻璃片（规格：76.2×25.4mm，厚度：1.0-1.2mm）（Livingstone，目录号：7105-1）
盖板（规格：24 x 50 mm，厚度：0.13-0.16 mm）（CITOTEST LABWARE MANUFACTURING，目录号：10212450C）
真菌菌株：F。葛根氏菌野生型菌株PH-1（NRRL 31084），AmCyanPH-1（Zhang等人，2012）和PH-1基因缺失突变体（Zhang等人。，2012和2016）
植物材料：小麦（小麦）品种中原98-68（易于禾谷镰刀菌，广泛培养于中国河南）
无菌水
V8蔬菜汁（CAMPBELL，目录号：V8 ® ORIGINAL）
碳酸钙（CaCO 3 3）
琼脂粉末/ /
绿豆
V8果汁琼脂培养基（He＆amp; et al。，2016;见食谱）
绿豆液体培养基（He＆et al。，，2016;见食谱）

设备

500毫升烧瓶
移液器（Eppendorf）
生长室（宁波江南仪器厂，型号：RXZ-1000）
模具栽培柜（益恒，型号：MJ-150-I）
生物安全柜（ESCO Micro，型号：FHC-1200A）
恒温摇床（太仓，型号：DHZ-DA）
血细胞计数器（0.10mm，1/400mm 2）（QIUJING，型号：XB-K-25）
荧光显微镜（Olympus，型号：Olympus BX51）
共焦显微镜（Olympus，型号：Fv10i）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-E系列）
相机（佳能，型号：EOS 7D）
高压灭菌器
规则

软件

ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index。 html ）
Microsoft Excel

程序

小麦苗的制备
1. 将小麦种子在室温下浸泡在500ml烧瓶中，用流水冲洗过夜（图1A）注意：为每次接种处理准备约20粒种子，以确保在一次实验中每次接种处理至少可以使用12个发芽幼苗。例如，为了检测两种突变型禾谷镰孢菌株的毒力，以及一种野生型菌株和模拟接种，需要浸泡80粒种子。
2. 将吸入的种子放入包含2层湿纱布（图1B）的医用搪瓷盘中，并在黑暗中将孪生子在25℃下在生长室中放置1天。
  注意：用盖子盖住托盘，以防止发芽期间纱布潮湿。
3. 将一小块纸巾放在24孔细胞培养板的每个孔中并用水浸泡。将发芽的种子移植到24孔细胞培养板中，每孔一个种子（图1C）
4. 在25℃的受控环境条件下，用12小时光/ 12小时暗光周期，在生长室中种植植物1天。
  
  图1.小麦种子发芽。将小麦种子在具有水（A）的烧瓶中漂洗一夜，然后转移到具有湿纱布（B）的搪瓷盘中。将发芽的种子移植到24孔细胞培养板（C）中。标尺的尺寸为mm。
分生孢子悬浮液的制备
1. 从股票文化中，选择少量的 F。 graminearum 使用无菌牙签将菌丝体转移到新鲜的V8琼脂平板上。将培养物在25℃生长室中孵育3-5天
2. 刮V8琼脂板，现在充满了无菌镊子的气生菌丝，并拿起一些碎片。将这些片转移到100ml灭菌的绿豆液体培养基中，然后在恒温振荡器中在25℃和150rpm下孵育3-5天。
3. 过滤绿豆液体培养基，然后将过滤的液体培养基收集到无菌的250ml离心瓶中。在室温下以7,500×g离心10分钟。
4. 弃去上清液，通过移液将分生孢子沉淀物重新悬浮在1 ml无菌水中，然后将分生孢子悬浮液转移到1.5 ml无菌离心管中。用无菌水清洗沉淀三次。
5. 将分生孢子沉淀物重新悬浮于无菌水中，并将浓度调至10分钟/分钟/ ml。
  注意：悬浮液应在2小时内用于接种。在接种前重悬分生孢子。
小麦胚芽鞘接种
1. 切断顶端1-2毫米的三日龄小麦幼苗的胚芽鞘，并加入2微升F。禾本科植物野生型或突变体悬浮液（10分钟/分生孢子/毫升）到剩余幼苗的顶部（图2B和视频1）。对于模拟接种对照，向受伤部位加入2μl无菌水注意：接种前检查幼苗的状态。准备接种的幼苗的胚芽鞘应该没有破裂，见图2A。
  
  图2.小麦幼苗与分生孢子悬浮液的接种 A.在第3天生长的小麦幼苗; B.小麦接种过程C.接种小麦幼苗; D.小麦幼苗横截面显微照片。插入（B）中间的图像显示在接种之前血细胞计数器上的分生孢子悬浮液的显微镜检查。 C：coleoptile; L：叶V：血管束。比例尺= 20μm
  
  Video 1. Process for wheat seedling inoculation
2. 在受控环境条件下在25℃下，在12小时光/ 12小时暗光周期和95％相对湿度下，将生长室中的接种植物再培养7天。荧光标记的禾谷镰刀菌菌株的感染进展可以在显微镜下追踪（步骤C4）。
  注意：在早期感染阶段（例如，接种后1天，dpi），由禾谷镰刀菌引起的损伤是不明显的。在2-3dpi下，接种部位的胚芽鞘转为深棕色，有空气菌丝（图3A）。
  
  图3. 的症状 F。小麦幼苗感染。白色箭头显示由 F引起的病变。菌。 B.增长。小麦胚芽鞘内的禾本科细菌菌丝菌丝。 H：菌丝PC：植物细胞。白色比例尺代表20μm。 C.感染小麦幼苗7dpi; D.由E.引起的病变大小。禾本科菌株。黑色比例尺表示1厘米。显示一个代表性实验的测量。数据是平均值±SD（ = 12），* 0.001（重要），Student's -test。
3. 通过用标尺作为参考，以7dpi测量受感染的小麦幼苗的胚芽鞘上的病变大小（图3C）。
  注意：重复实验至少三次，每次处理至少使用12个幼苗。
4. 通过荧光标记的F显微镜观察小麦胚芽鞘感染。禾本科菌株菌株（可选）。
  分生孢子在10 h接种后（HAI）内在胚芽鞘表面发芽，并迅速在宿主组织内从16个HAI快速扩散至64个HAI（Zhang等人，2012）。
5. 化学处理（图4）（可选）。

数据分析

使用ImageJ在指定时间测量小麦胚芽鞘上的褐色病变的纵向长度作为病变大小（图5）。打开在ImageJ中的7dpi拍摄的照片，并选择直线选项，以照片的尺寸测量1厘米的尺子，并将长度设置为1厘米。然后测量棕色病变的长度（图5A）并将测量值导出到Excel表（图5B）。使用Student's t 测试或单因素方差分析用Microsoft Excel分析毒力（图5C）。减小的病变大小被解释为F的毒力降低。禾谷镰刀菌在小麦胚芽鞘上（图5D）

图5.损伤尺寸测量和统计分析。：一种。在野生型（WT）或突变体（M1）菌株接种7天后的幼苗的代表性图像。菌。红线表示ImageJ直线工具测量病变大小。 B.来自三个独立实验的WT和M1的病变大小的样本数据集。 C.计算实验平均病变大小和标准误差（SE）的平均值，并执行测试分析。 D.结果以条形图表示。

笔记

在步骤C2中，在F的感染进展期间保持高湿度环境是重要的。菌。

食谱

V8果汁琼脂培养基（1L）
168毫升V8蔬菜汁
1克CaCO 3
15克琼脂粉末在121℃高压灭菌20分钟
绿豆液体培养基（1升）

40克绿豆（Vignaradiata ）（干，可在杂货店或超级市场上购买）
将绿豆放入沸水中，然后煮沸约10分钟，冷却至室温
过滤纱布并丢弃豆渣
用蒸馏水加入1升
在121℃高压灭菌20分钟

致谢

我们感谢Sheila McCormick博士编辑这个协议。该方案从以前的接种方法Wu等人，2005年和Zhang等人于2012年进行了修改。唐实验室的研究得到农业部的支持中国（授权2016ZX08009-003），中国国家重点研究发展计划（授权2016YFD0100600）和中国科学院战略重点研究计划（XDB11020500）。

参考

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