材料和试剂

移液器提示
Nalgene Oak Ridge高速PPCO离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：3119-0050）
1.7ml微量离心管（MIDSCI，目录号：AVSS1700）
带超薄膜的Amicon Ultra-0.5离心过滤器（EMD Millipore，目录号：UFC501024）
铝箔（Fisher Scientific，目录号：01-213-100）
过滤器（0.22μm）
细菌生长培养基（物种特异性）
粟粒微球菌ATCC No.4698，冻干细胞（Sigma-Aldrich，目录号：M3770）
来自猪胰腺的α-淀粉酶（Sigma-Aldrich，目录号：A6255）
苍耳酶蛋白酶，灰色链霉菌（EMD Millipore，目录号：53702）
1 N HCl
叠氮化钠（NaN 3 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
来自全球链球菌（ATCC）的Mutanolysin（Sigma-Aldrich，目录号：M9901）
硼氢化钠（Sigma-Aldrich，目录号：213462）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：S369）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：S373）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-100）
硼酸（Acros Organics，目录号：327132500）
水（HPLC级）（Fisher Scientific，目录号：W5SK-4）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：S318-1）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：BP366）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285）
O-磷酸，85％（HPLC）（Fisher Scientific，目录号：A260-500）
甲醇（HPLC级）（Fisher Scientific，目录号：A452SK-4）
三氟乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：302031）
乙腈（HPLC级）（Fisher Scientific，目录号：A998）
磷酸盐缓冲液pH = 6（PB）（参见食谱）
具有8％（w / v）SDS的PB（参见食谱）
0.5 M硼酸盐缓冲液pH = 8（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
HPLC分离缓冲液A（参见食谱）
HPLC分离缓冲液B（参见食谱）
HPLC脱盐缓冲液A（参见食谱）
HPLC脱盐缓冲液B（参见食谱）

设备

Kimax挡板培养瓶（Fisher Scientific，目录号：10-140-6A和10-140-6B）
制造商：DWK Life Sciences，Kimble，目录号：25630250和25630500。
移液器（Gilson，目录号：F167700）
Nalgene PPCO离心机瓶500毫升（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：3120-0500）
SLA-3000固定角转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：07149）
SS-34固定角度转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：28020）
Sorvall RC-6 plus（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall RC 6 Plus，目录号：46910）
HiTemp热水浴（Fisher Scientific，目录号：11-481Q）
Accumet AB150 pH台式仪表（Fisher Scientific，型号：Accumet AB150 TM，目录号：13-636-AB150）
UV-Vis分光光度计（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：GENESYS TM，目录号：840-208100）
Vortex-Genie 2（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
Astec C18 HPLC柱（Sigma-Aldrich，目录号：55024AST）
注意：本产品已停产。
贝克曼库尔特系统黄金HPLC与126溶剂模块，168检测器和SC100馏分收集器（Beckman Coulter，型号：System Gold）
注意：本产品已停产。

程序

细菌培养物的生长
1. 长达200毫升或更大的细菌培养物以获得足够的肽聚糖用于分析革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性菌可能使用较少的培养物。使用适合生长细菌的生长培养基。由于肽聚糖的组成与生长相关（Pisabarro等人，1985），重要的是所有培养物生长至相同的光密度以限制由于生长期的差异。以对应于中期或后期对数生长期的最终光密度收集细胞将提供高产量的细胞，同时最小化收获死亡或裂解细胞的机会。
2. 一旦细胞达到所需的光密度，在冰浴中冷却培养物并转移到500ml离心瓶中
3. 在4℃下以5,000×g离心培养物10分钟。
4. 用25ml冷PBS将上清液和上清液洗涤一次
5. 在4℃下以5,000×g离心培养物10分钟。去除上清液，并在-80℃保存细胞沉淀。
从细胞中分离大分子肽聚糖
1. 将冷冻细胞沉淀悬浮于10ml PB（25mM磷酸钠pH = 6，参见食谱）中。微酸性pH保护一些细菌物种中存在的乙酰基。
2. 对于每个细胞沉淀物，加入10 ml具有8％（w / v）SDS的PB至新的Oak Ridge管，并将管置于沸水浴中。
3. 将细胞悬浮液逐滴加入含沸点SDS的管中。盖上带有铝箔的管子，以防止蒸发，并置于沸水中。煮沸样品30分钟。
4. 盖管并允许它们平衡至室温。不要在冰上冷却样品，因为会导致SDS沉淀。
5. 在15℃下以45,000×g离心机在SS-34转子中离心30分钟，以沉淀不溶性肽聚糖。
6. 滗析含有可溶性细胞成分的上清液。肽聚糖颗粒将出现玻璃状，约为缩略图的大小（图1）。
  
  图1.造粒肽聚糖。第一次沸腾SDS处理后的肽聚糖洗涤（左）和第二次煮沸的SDS处理（右）。
7. 通过加入10ml PB洗涤沉淀，并旋转直到颗粒完全悬浮。在15℃下以45,000×g离心机在SS-34转子中30分钟。
8. 重复上一次洗涤步骤去除SDS。残留的SDS会引起每次洗涤会降低的泡沫。继续洗涤，直到没有更多的SDS的迹象，通常根据初始培养物的大小4至6次洗涤。
9. 最后一次洗涤后，将沉淀悬浮于1 ml PB中，并转移到微量离心管中注意：在这一点上，神经与大多数细胞组分没有共价结合。用α-淀粉酶和链霉蛋白酶处理分别去除被捕获的高分子量糖原和肽聚糖相关蛋白。对于革兰氏阳性，在用链霉蛋白酶处理后，还需要额外处理1N HCl以除去磷酸（Kuhner等人，2014）。
10. 将α-淀粉酶盐水悬浮液稀释至1毫克/升的工作浓度。向每个悬浮的肽聚糖颗粒中加入100μg的α-淀粉酶。短暂旋涡，37℃孵育1小时
11. 用必需的链霉菌粉末溶解至2毫克/升。向每个悬浮的肽聚糖颗粒中加入200μg的链霉蛋白酶。短暂旋涡并在37℃下搅拌孵育2小时至过夜。
12. 将样品滴加到含有10 ml PB的橡胶岭管中，4％（w / v）SDS放入沸水浴中煮沸30分钟。
13. 盖管，允许样品平衡至室温。
14. 在15℃下以45,000×g离心在SS-34转子中的样品30分钟并倾析上清液。将沉淀的肽聚糖悬浮于10ml PB中。重复旋转和洗涤，直到不残留SDS。
15. 最后一次洗涤后，将肽聚糖悬浮于0.5ml PB中，然后将样品标准化至4mg ml -1。肽聚糖可以使用微球菌溶菌酶的标准曲线进行标准化，并测量206nm或254nm处的吸收。 206 nm处的吸光度用于检测羧基，酯键和肽键，而254 nm处的吸光度用于检测聚糖骨架的糖。样品可以长期保存在-20°C，或者可以在4°C下与0.02％叠氮化钠一起储存一个月，可能更长时间。
HPLC的肽聚糖片段的制备
1. 将0.5ml（2mg）纯化的肽聚糖转移到微量离心管中，并加入10μl2mg ml -1的溶血素。在37℃下孵育4小时，搅拌过夜。重要的是，在添加溶血素之前，肽聚糖的浓度足够高，因为不溶性片段不能通过离心浓缩。
2. 通过以14,000xg离心5分钟，用0.5ml水洗涤Amicon Ultra-0.5离心过滤器Ultracel-10两次，并丢弃流过以除去膜上痕量的甘油。不要让膜完全干燥。
3. 为了除去溶菌解蛋白酶和不溶性肽聚糖，用新的收集管将经溶解解菌素消化的样品加入洗涤的过滤器中，并以14,000xg离心20分钟。
4. 将含有可溶性肽聚糖片段的流通转移到新的微量离心管中并丢弃过滤器。
5. 在化学品罩中，在使用前立即加入10毫克/升的硼氢化钠至0.5M硼酸盐缓冲液（参见食谱）。
  注意：在处理硼氢化钠之前，请阅读MSDS的必要处理注意事项。避免与皮肤接触，并注意与水剧烈反应。硼氢化钠反应迅速产生足够的氢气，在微量离心管上弹出盖子，足够的力使管子跳动并将样品喷在一米上。重要的是，微型离心机盖可以用盖锁固定或打开。
6. 向可溶性肽聚糖样品中加入等体积的硼氢化钠溶液（0.5ml）。涡旋，然后在化学品罩中取样，10分钟后重复。硼氢化钠用于还原糖，以使每个片段作为单个峰值洗脱。
7. 完全20分钟后，通过在每个反应中加入约20μl的85％磷酸将pH调节至2至4停止反应。肽聚糖分离和HPLC制备的概述可以在图2中看到。
  
  图2.准备肽聚糖进行HPLC分析所需步骤的总结和简要说明
通过HPLC检测神经肽
1. 设置运行分离缓冲液A（参见食谱）10分钟的HPLC方法，然后以0.5ml /分钟的流速在120分钟内从0分钟缓冲液B到达100％的分离缓冲液B（参见食谱）。使用206 nm波长检测峰。建议注射回路为0.5毫升。使用反相十八烷基二氧化硅（ODS）C18柱分离神经肽。设置为30°C的色谱柱培养箱将确保更一致的分离。
2. 运行一个空白（仅缓冲液）样品建立基线，并确保残留在色谱柱上的污染残留化合物。在每次运行后用100％缓冲液B以1ml / min的速率清洗柱子，然后用100％缓冲液A以1ml / min的速度平衡30分钟。 >在每次运行之前。
  注意：神经肽的保留时间取决于缓冲液的pH，溶剂的百分比和温度（Glauner，1988）。缓冲液pH值接近等值点，即使使用良好的pH计也难以准确地复制。制作足够的缓冲区以运行所有比较样品是有用的。将色谱柱维持在30°C也有助于使保留时间更加一致。甲醇引起基线漂移，可以使分析更加困难。一种解决方案是加入约10μg/ ml的叠氮化钠（NaN 3 N 3）以降低吸光度（Glauner等，1988）。使用较新的检测器，可以通过从样品运行中减去空白运行或使用参考波长来固定基线漂移。
3. 每个HPLC运行注射高达0.5毫升的样品。如果需要，在馏分收集器中收集1分钟（0.5ml）级分的分离的神经肽，以便以后通过质谱法进行分析/确认。肽聚糖片段峰将分离并形成可以使用206 nm处的吸光度可视化的峰（图3）。
4. 可以通过使用HPLC附带的软件测量峰值下的面积来量化每种类型的肽聚糖片段的量。
  
  图3.来自棒状大肠杆菌和淋球菌双球菌的分离的肽聚糖片段的色谱图。许多肽聚糖片段在物种之间是相同的，如两个显着的Tetra和Tetra-Tetra片段。一些差异是由于。具有O-乙酰化肽聚糖的Gonorrhoeae，但缺乏Braun的脂蛋白和Tri-Lys-Arg附着物。峰值的身份遵循Glauner（1988）使用的命名约定。
通过质谱鉴定肽聚糖峰
1. 用于分离肽聚糖峰的缓冲液中的磷酸盐与许多质谱法不相容。通过HPLC对肽聚糖峰进行脱盐，使用真空浓缩器将含有目标峰和浓缩物的第一池级分。
2. 然后将样品在相同的C18 HPLC柱上脱盐。创建一个运行100％脱盐缓冲液A（参见食谱）10分钟，然后从0％至100％脱盐缓冲液B（参见食谱）10分钟的梯度和100％脱盐缓冲液B另外10分钟的程序1 ml min -1 。可以使用更渐进的梯度来分离含有多于一种类肽聚糖片段的峰。
3. 如前所述，运行空白样品建立基线，然后运行样品并使用级分收集器收集洗脱的肽聚糖片段。
4. 收集含有您的肽聚糖片段的真空浓缩物。质谱可以通过正离子电喷雾离子化飞行时间质谱（POS ES-TOF）或基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF MS）质谱法测定。

数据分析

为了比较细菌株，生长条件或突变，应使用至少三个来自独立培养物的肽聚糖样品。使用206nm处的吸光度（A <206）来鉴定感兴趣的峰。建立基线对分析很重要，特别是对于具有较长保留时间的较大片段。 HPLC系统之间的软件将不同，但与样品运行方式和数据分析方式一致将确保准确的比较。
表达峰面积（也称为峰面积）的两种常见方式如吸光度/分钟和总色谱图百分比。第二个选项提供更多的生物相关性，并且当注射的肽聚糖的量不相等时，更容易获得样品。可以使用假定相等方差的双样本t检验比较生物学重复，以比较样品之间的等效峰。
注释色谱图和其他信息可以在（Glauner，1988; Glauner等人，1988; Pisabarro等人，1985; Antignac等人， / em>，2003b）。

食谱

PB（25mM磷酸缓冲液pH = 6）
0.2973％（w / v）NaH 2 PO 4·2H 2 O / / 0.0926％（w / v）Na 2 HPO 4·7H 2 O
确认pH = 6，高压釜
PB含8％（w / v）SDS 0.2973％（w / v）NaH 2 PO 4·2H 2 O / / 0.0926％（w / v）Na 2 HPO 4·7H 2 O
8.0％（w / v）SDS
0.5M硼酸盐缓冲液pH = 8

将6.18克硼酸溶于140毫升水中
用10N NaOH调节pH至8
调节体积至200 ml
过滤灭菌（0.22μm）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH PO 4
高压灭菌并储存在4°C
HPLC分离缓冲液A（50mM磷酸钠pH = 4.33）

将2.0 g NaOH溶于700 ml HPLC级水中
用磷酸调节pH至4.33
用HPLC级水将体积增加至1升
过滤灭菌（0.22μm）和脱气

HPLC分离缓冲液B（50mM磷酸钠pH = 5.10，15％（v / v）甲醇）

将1.7 g NaOH溶于600 ml HPLC级水中
用磷酸调节pH至5.10
使用HPLC级水将体积增至850毫升
加入150 ml甲醇
过滤和脱气密封容器以防止蒸发

HPLC脱盐缓冲液A
具有0.05％（v / v）三氟乙酸的HPLC级水分
HPLC脱盐缓冲液B
含有0.05％（v / v）三氟乙酸的50％乙腈（50％HPLC级水）

致谢

这项工作得到NIH授权R01 AI097157的支持。 Dillard博士就辉瑞公司就他们的脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗专利工作提供咨询，并收到咨询费用。该方案从（Dougherty，1985）和（Glauner等人，1988）改编而来。

参考

Antignac，A.，Boneca，IG，Rousselle，JC，Namane，A.，Carlier，JP，Vazquez，JA，Fox，A.，Alonso，JM和Taha，MK（2003a）。＆lt; a class = -insertfile的” href =‘http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12799360’目标=‘_空白’>中青霉素结合蛋白2的改变和肽聚糖结构的变型之间的相关性脑膜炎奈瑟氏菌脑膜炎奈瑟氏球菌具有降低的对青霉素G的敏感性。 J Biol Chem 278（34）：31529-31535。
Antignac，A.，Rousselle，JC，Namane，A.，Labigne，A.，Taha，MK和Boneca，IG（2003b）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12799361" 目标= “_空白”>人病原体脑膜炎奈瑟氏球菌。生物化学杂志 278（34）：31521-31528。
Araki，Y.，Nakatani，T.，Hayashi，H。和Ito，E.（1971）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 4993454“target =”_ blank“>来自蜡状芽孢杆菌细胞壁的溶菌酶抗性肽聚糖中发生非 N - 取代的葡糖胺残基。 Biochem Biophys Res Commun 42（4）：691-697。
Clarke，AJ和Dupont，C。（1992）。＆nbsp; 乙酰化肽聚糖：其发生，病理生物学意义和生物合成。 Can J Microbiol 38（2）：85-91。
Clarke，TB和Weiser，JN（2011）。细胞内细胞外细菌的传感器。 Immunol Rev 243（1）：9-25。
Desmarais，SM，De Pedro，MA，Cava，F.and Huang，KC（2013）。＆nbsp; 肽聚糖在其峰上：色谱分析如何揭示细菌细胞壁结构和组装。分子微生物89（1）：1-13。

Dougherty，TJ（1985）。分析淋病奈瑟氏球菌通过反相高压液相色谱进行肽聚糖。 J Bacteriol 163（1）：69-74。

Glauner，B。（1988）。＆nbsp; 分离和量化具有高效液相色谱法的神经肽。 Anal Biochem 172（2）：451-464。

Glauner，B.，Holtje，JV和Schwarz，U.（1988）。＆nbsp; 大肠杆菌的murein的组成。生物化学263（21）：10088-10095。

Holtje，JV和Tuomanen，EI（1991）。大肠杆菌的murein水解酶：对体内感染过程的性质，功能和影响。 J. Gen Microbiol 137（3 ）：441-454。

Kato，K.和Strominger，JL（1968）。葡萄球菌细胞壁的结构。 IX。由L11酶水解的机理。生物化学 7（8）：2745-2761。

Kuhner，D.，Stahl，M.，Demircioglu，DD和Bertsche，U.（2014）。＆nbsp; 在24小时内从细胞到神经肽结构：UPLC-MS进行肽聚糖作图。 4：7494.

Markiewicz，Z.，Glauner，B.and Schwarz，U.（1983）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6630150”目标=“_空白”>霉素结构和在新月牙菌中没有DD-和LD-羧肽酶活性。 J Bacteriol 156（2）：649-655 。

Pisabarro，AG，de Pedro，MA和Vazquez，D。（1985）。与大肠杆菌的肽聚糖的结构修饰相关，与文化生长状态的变化有关。>细菌学161（1）： 238-242。

Schleifer，KH和Kandler，O.（1972）。肽聚糖类型的细菌细胞壁及其分类学意义。 36（4）：407-477。

Ward，JB（1973）。＆nbsp; 链长聚合物在细菌细胞壁中。生物化学J 133（2）：395-398。