预处理FBS
1. 如果FBS以等分试样（-20℃或-80℃）冷冻，则解冻适量的FBS以制备所需体积的CeM1培养基（FBS的终浓度为8％）。注意，FBS的预处理由于在炭 - 葡聚糖中捕获FBS而导致体积的〜20％的损失，例如，25ml的FBS将产生约20ml的预处理的FBS。 FBS可以在室温或37°C水浴中解冻。预处理包含两个隔夜培育步骤。 FBS与Amberlite IRA 400-CL珠粒和木炭葡聚糖的孵育可除去疏水性分子，如类固醇激素。预处理步骤需要在CeM1培养基中维持生殖细胞活力（Chaudhari等人，2016）。不知道预防如何改变FBS以改善细胞存活。
2. 通过在温度控制的水浴中，在56-65℃温育30分钟，使偶尔的旋转（每5-10分钟），将热解灭活。
3. 预洗一定量的Amberlite IRA 400-CL珠粒，其基于将经受预处理的每ml FBS的最终浓度为50mg的珠粒;对于25ml的FBS，这将是1.25g珠。对于预洗，将珠子放在15ml或50ml聚丙烯管中。通过向管中加入分子级水（〜13或〜45ml，取决于是否使用15ml或50ml管）并将管反转多次，将珠预先洗涤。通过在台式离心机中以930×g离心1分钟收集珠粒。吸出珠子上方的水。重复洗两次。通过将1000μl移液管针头放在管底部并移出水分，清除珠子之间的残留水。
4. 用洗涤的Amberlite IRA 400-CL珠将热灭活的FBS加入到管中
5. 将FBS和Amberlite IRA 400-CL珠在室温下以单速旋转器旋转4-6小时。
6. 预先洗涤第二组Amberlite IRA 400-CL珠（1.25g，25ml FBS），如步骤A3所示。
7. 将珠子（930 x g）旋转1分钟，并将FBS转移到第二批洗涤的Amberlite IRA 400-CL珠粒中。
8. 旋转FBS和珠子4°C旋转过夜。
9. 第二天，准备木炭葡聚糖与FBS孵育。木炭葡聚糖的量基于每毫升FBS最终浓度为100mg的木炭葡聚糖;对于25ml FBS，这将是2.5g的木炭葡聚糖。将木炭葡聚糖预先压在称重盘的一侧，以分解成块。放入15ml或50ml聚丙烯管中
10. 将Amberlite IRA 400-CL珠子（930 x g）旋转1分钟，然后将FBS转移到带有木炭葡聚糖的管中。
11. 旋转FBS与木葡萄糖在4°C旋转器过夜。
12. 通过两次连续离心除去木炭葡聚糖，每次离心分别为2,850 xg 30分钟，4℃，然后将FBS转移到新的聚丙烯管（留下一小部分，约100μl，超过颗粒，以确保没有留下来自颗粒的残留物）。
13. 已经通过热灭活处理的FBS和与Amberlite IRA 400-CL和木炭葡聚糖的温育可以立即使用，在4℃下储存一至两周，或储存更长时间（几个月或几年））在-80℃（快速冷冻等分液体在液氮中）
  注意：
制备CeM1培养基
1. 在没有用肥皂（例如，500ml以前保持水，PBS或组织培养基的塑料瓶）洗涤的瓶子中制备CeM1培养基，并通过用蒸馏水冲洗和空气干燥）。如果制备的培养基少于50ml，则可以用50ml的聚丙烯管制成。
2. CeM1成分的百分比/浓度见表1.最初，添加Schneider的昆虫培养基，Leobovitz的无酚红的L-15培养基，预处理的FBS，青霉素/链霉素，RPMI维生素和诺卡诺霉素。
  
  表1. CeM1介质成分
3. 加入10毫克/毫升乙醇中的胆固醇（参见食谱）。
4. 加入18毫克/毫升海藻糖，旋转瓶子溶解粉末。这应产生低于所需390 mOsm的渗透压。
5. 加入还原的L-谷胱甘肽作为粉末，旋转容器溶解
6. 从新鲜制备的4mM储备液中加入氯化血红素（参见食谱）。
7. 通过加入5N NaOH将pH调节至6.5
8. 在测量之前将其打开30分钟，然后用100,290和1,000 mOsm标准进行校准，准备冰点渗透压计。
9. 用凝固点渗透压测定CeM1培养基的重量摩尔渗透压浓度。重量摩尔渗透压浓度应低于390 mOsm所需的渗透压。
10. 通过添加额外的海藻糖（通过旋转溶解）将CeM1培养基的重量克分子渗透浓度调节至390mOsm / kg。
11. 通过0.22μm的150或500 ml过滤器单位对CeM1培养基进行无菌过滤
12. 将无菌CeM1培养基转移到15ml或50ml聚丙烯管中，使其可以以少量空气等量存储在容器中（以限制蒸发和冷凝）。将等分试管存放在4℃，包裹在铝箔中以保护其免受光照。等分试样可以使用至少两个月。
制备热灭活的OP50细菌
1. 在2×YT细菌培养基中培养1升OP50细菌在37℃下过夜
2. 在4℃下将细菌以3,700 x g 旋转30分钟，倾倒液体。
3. 重悬于5ml的0.9％NaCl中，置于15ml聚丙烯管中
4. 将管子置于62-67℃的水浴中孵育24小时
5. 在4℃下储存热灭菌细菌。
  
  注意：不要旋转热灭菌的细菌，这会压制细菌。在使用细菌之前，用1,000μl过滤嘴（用70％乙醇清洗移液器的轴进行消毒），上下移动，重新悬浮溶液。
肿瘤突变体的制备
1. 该程序的卵源可以是混合种群的肿瘤种系突变体，其包含妊娠成虫（即，即，其身体中具有卵的成虫）和产卵。接种OP50细菌的一个10cm 3x NGM琼脂平板（参见食谱）和混合阶段动物的稍微密集的群体通常将足以提供足够的蛋用于该程序。如果使用温度敏感（ts）肿瘤种系突变体，3x NGM琼脂平板应在15-16℃的允许温度下在低温培养箱中孵育，以使突变体产生蛋。大多数小规模实验中有几百个蛋已经足够了，例如，25只成年人（来自鸡蛋）用于分离24孔板每个孔的生殖细胞（每个具有0.5ml中）。
2. 收集C.线虫通过用M9缓冲液冲洗并用细胞刮刀在M9缓冲液中刮洗鸡蛋，从板中取出。刮削是通过一只手倾斜板以大约30°的角度进行的，这使得M9缓冲器沉降到倾斜板的底部。另一方面，使用细胞刮刀将细胞和细菌移动到M9液体中。然后将板旋转，使得具有完整细菌的区域被带到板的顶部，在那里它们可以被刮到液体中。当所有细菌和鸡蛋都在M9缓冲液中时，将液体用无菌玻璃巴斯德移液管转移到15ml聚苯乙烯管中。
3. 通过在930 x g下离心1分钟来旋转动物和鸡蛋。
4. 吸入液体，并加入8 ml次氯酸钠溶液（参见食谱），并频繁反转孵育约3.5-4.5分钟。在孵育期间，偶尔将15 ml管置于立体显微镜上观察动物。应该继续与次氯酸钠孵育，直到几乎所有的成年人都破碎了一半，释放出卵子。
5. 将930 x x 的鸡蛋旋转1分钟，吸出溶液
6. 用无菌M9溶液洗涤四次（每次充满15ml管）。
7. 使用无菌巴斯德吸管将无菌卵（少量M9）置于OP50种子3x NGM板上。尽管不是必需的，如果需要更成熟的成年人群，则将无菌卵代替放置在10毫升培养皿中的5毫升/ 5升胆固醇的15毫升M9中，并在室温下放置过夜鸡蛋孵化，并在L1幼虫阶段捕获由此产生的幼虫。然后可以使用玻璃巴斯德移液管将L1幼虫收集在聚苯乙烯15ml管中，旋转下来，抽吸多余液体，并将小量的M9（〜100μl）的卵加入到OP50种子的3x NGM板中。
8. 将3x NGM板在25℃的低温培养箱中放置鸡蛋4天。在此期间，动物将发育成为具有种系肿瘤的成年人（图1）
  
  图1.野生型和肿瘤突变体的立体显微镜图像 C。线虫成年雌雄同株在25°C生长。请注意，在daf-16（mu86）中; CKI-2（ok2105）; glp-1（ar202）突变体，种系肿瘤在体内可见为白色区域（箭头）。比例尺= 100μm。
9. 通过将M9溶液加入到板的边缘并从无菌的巴斯德移液器将浮动的动物从板上转移到15ml聚苯乙烯管中（不干扰细菌草坪），从板中收集种系肿瘤突变体动物。
10. 用〜14ml M9缓冲液洗涤收集的突变体动物四次以除去活细菌（每次洗涤230℃旋转1分钟）。
11. 将洗涤的动物加入到含有2.5ml含有热灭活细菌的富含抗生素的PBS的12.5cm 2细胞培养瓶中（参见食谱）。
12. 紧紧关上烧瓶，并在低温培养箱中于25℃孵育过夜
  注意：
生殖细胞分离
1. 将动物从抗生素培养物中收集到15ml聚苯乙烯管中并旋转（所有与成年动物的旋转物230μg×1分钟）。
2. 用无菌PBS（灌装管）清洗动物四次。
3. 用5ml CeM1培养基洗一次。
4. 在组织培养罩中，将洗涤的动物重悬于2ml CeM1培养基中并置于35mm组织培养皿中。
5. 准备第二个35毫米的组织培养皿，在培养皿中心用120微升的CeM1培养基圈，将其用于分离生殖细胞。
6. 将板从组织培养罩中取出到底部照明的立体显微镜。在通过立体显微镜观察动物时，使用铂线蠕虫从2ml板转移到活动动物（其自身移动或移动）到第二盘中的120μl圆形的CeM1培养基。将所需数量的动物移动到120μl的圆圈（通常每个孔用24孔板，每个孔使用25个成年雌雄同株，或96孔板每孔8个;我们收获的生殖细胞最多可达240只动物一个120μl圆）。用于转移的蜗杆皮是带有扁平端的拉直的铂线，在端部之前略微弯曲，使得当线被放置在多个蜗杆下方并且被直线抬起时，蜗杆被覆盖在线的两侧因为它从媒介中提升出来。然后，通过将蠕虫放在介质中，然后用轻微的来回运动将它们移动到介质圈。移动的任何不动的蠕虫都会用导线的扁平端移除。
7. 在通过立体显微镜观察时，使用21号针将120μl圆圈中的动物切成四分之一。为了切割动物，将一只针放置在动物的一侧，将另一根针放置在动物的另一侧，然后滑动通过动物（第一针的第二针），产生剪刀状切割动作（图2）。从动物挤出的完整的性腺也被切断。
  
  图2.动物释放生殖细胞的解剖为了解剖动物，将针放置在动物的任一侧，如（A）所示。背景中的针沿前针（A中的箭头方向）前进。剪刀式动作导致动物的解剖（B）。然后每次解剖动物的一半以产生较小的身体部位（如主动物周围所示）。
8. 将板带回组织培养罩。将1ml CeM1培养基加入到具有1000μl移液管末端的板中，同时将板保持在〜30°角。用移液管取出1 ml的CeM1，并将其强力推出到板的中间（塑料已被针刻划/划伤）;共重复20次。在喷射时不要从吸管中释放出所有的介质，因为这会产生气泡，因为气泡表面张力会导致细胞死亡。
9. 将所有液体从板上转移到15ml聚丙烯管的底部。
10. 将第二个1ml的CeM1培养基相对于板的中心（仍然保持在-30°角）八次，并加入到相同的15ml管中。
11. 将第三个1ml CeM1培养基直接加入到15ml管中，并将液体上下移动〜10次（再次避免将移液管中的所有液体移出吸头，以防止形成气泡）。
12. 将管子以21-230×g旋转1分钟以沉淀身体部位和大细胞聚集体。离心速度的选择影响分离的生殖细胞的分布：在21×g下旋转将在上清液中保留大的细胞聚集体;在230×g下旋转将去除大的细胞聚集体，在上清液中仅留下单个细胞和小细胞聚集体。
13. 将上清液转移到新的15ml聚丙烯管中，并旋转930×g 5分钟以沉淀细胞。
14. 吸出上清液，并通过用具有相对较宽的开口的1,000μl移液管吸头（通过指定的康宁移液器吸头）发现，用新鲜的CeM1培养基重悬细胞沉淀。基于收获的动物数将细胞转移到组织培养皿中。通常，对于96孔板（8只动物/孔）的每个孔使用0.08ml。对于24孔板（25只动物/孔）的每个孔0.5ml，和2ml用于在35mm组织培养皿（> 50个动物/皿）中培养。可以根据实验改变细胞与培养基的比例。
15. 如果使用多孔组织培养皿并且外部孔不含细胞，则用无菌PBS填充外部孔以限制从包含分离的生殖细胞的孔中蒸发。
16. 用Parafilm密封组织培养皿或板的边缘（以限制蒸发）。
17. 在25℃的温度下，在密闭容器中的低温培养箱中孵育
18. 可行的生殖细胞可以维持长达四周。
19. 用相差倒置显微镜观察分离的生殖细胞（图3）
  
  图3.分离的相对比和Hoechst 33342 DNA染色 C。线虫生殖细胞。细胞在分离后一天成像。比例尺= 10μm

数据分析

可以按照Chaudhari等人，2016所述确定体外分离的活的生殖细胞的数量。为了计数活细胞，细胞用活的细胞染色钙黄质素-AM，死细胞染色乙锭同型二聚体和DNA染色剂Hoechst 33342.Calcein-AM可以自由地扩散到活细胞中，然后被细胞酯酶转化成不能穿过完整质膜的荧光形式并因此保留在细胞内。乙二胺二聚体污染缺乏完整质膜的死细胞。细胞渗透染料Hoechst 33342允许核DNA的可视化。计数活细胞和死细胞的程序如下。

将分离的生殖细胞在组织培养基中用过滤的1,000μl移液管末端轻轻混合。
将40μl的细胞转移到0.5ml离心管中，加入新的1,000μl移液管。
注意：建议使用1,000μl的吸头，因为尖端的开口足够大，以防止细胞在吸入尖端时被损坏。
将Hoechst 33342，钙黄绿素AM和乙锭同型二聚体（见食谱）的混合物在CeM1中以1:10稀释，然后将1μl稀释液与40μl细胞混合。最终浓度为5μg/ ml Hoechst 33342; 1μM钙黄绿素AM;和0.1μM乙锭同二聚体。
将细胞管包裹在铝箔（阻挡光）中，并在室温下在养分器上孵育30分钟。
将20μl移液管的移液管末端用剃刀刀片（从70％乙醇洗涤消毒灭菌）至尖端约5毫米，以使开口更大，并用于重悬染染色细胞，然后〜将10μl溶液加载到血细胞计数器中。
在直立的化合物荧光显微镜上分析血细胞计数器。活细胞用钙黄绿素AM（绿色）染色，含有Hoechst 33342（蓝色）染色的细胞核，但缺乏用同型二聚体（红色）染色。死细胞用乙二胺二聚体染色，但缺乏钙黄绿素AM染色

如果与大肿瘤的雌雄同体被选择用于解剖，如果使用低速用于初始旋转（去除动物部分和较大的细胞聚集体），则雌雄同体可以分离出高达6,000个活的生殖细胞（Chaudhari等人， / em>，2016）。如果使用较高的速度进行初始旋转，则分离的生殖细胞的数量将会减少，因为这将消除更多的聚集的生殖细胞。从野生型动物（活细胞因其合胞体性质不能分离的细胞）分离的细胞对ET507肿瘤种系突变体的分析显示，来自ET507的分离的细胞中有超过99％是生殖细胞（Chaudhari < et al。，2016）。

食谱

2xYT细菌培养基 16克胰蛋白胨
10g酵母提取物
5克NaCl
1升蒸馏水
向2升锥形瓶中加入成分，盖上铝箔，高压灭菌30分钟
LB细菌培养基
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
0.2 ml 5 N NaOH 1000毫升蒸馏水
通过与搅拌棒混合来溶解组分。等分至十个100ml瓶子，高压灭菌20分钟注意：该配方是LB细菌培养基的常规配方，但与原始LB培养基（Bertani，1951）不同之处在于不含0.1％葡萄糖。
3x NGM琼脂平板接种OP50细菌

3克NaCl
7.5g细菌蛋白胨
20克琼脂
1 ml 5 mg / ml胆固醇（溶于100％乙醇中）
1ml 1M MgSO 4
1ml 0.1M CaCl 2
972毫升蒸馏水
加入2升三角烧瓶中，然后用铝箔覆盖
分别制备50ml锥形瓶或其他小玻璃容器（用铝箔覆盖），并装满：25ml 1M KH 2 PO 4 /
将2L烧瓶，小容器和1L带手柄（铝箔覆盖）的塑料浇注量杯高压灭菌30分钟
高压灭菌后，加入烧瓶中的1升25毫升1M KH 2 O 3 PO 4。旋转，倒入1升量杯中。等待气泡消失。倒入10厘米培养皿。让琼脂板空气干燥两天
在LB培养基中生长OP50细菌的过夜培养物。将少量的过夜的OP50 / LB培养物用10毫升的玻璃移液管（具有完全光滑的尖端）在每个平板上，用玻璃移液管将细菌铺展在板的表面上，留下一个“未固化”的空间板的边缘
将板在室温下孵育两天，然后放在原来保持培养皿的塑料套筒中，用胶带密封，并在4℃下储存直到需要。这些板可以使用一到两个月

注意：该配方是常规NGM配方的修改（Sulston和Hodgkin，1988）;它的不同之处在于它含有三倍高浓度的蛋白胨，以允许细菌生长较为繁琐

M9缓冲区
11.32g Na 2 HPO 4·7H 2 O
3g KH 2 PO 4
5克NaCl
0.012g MgSO 4
将蒸馏的H 2 O加入1L
等分至十个100ml瓶子，高压灭菌20分钟注意：该配方是常规M9缓冲配方的修改（Sulston和Hodgkin，1988）;它的不同之处在于它含有较低浓度的MgSO 4，以防止高压灭菌后的盐沉淀。
次氯酸钠溶液
5.4份蒸馏水
3份次氯酸钠（6％）或常规漂白剂
1.6份5N NaOH
在使用前准备新鲜的15 ml或50 ml聚丙烯管
创建一个铂金线虫
1. 切割3-4厘米的0.25毫米直径的铂丝线，
2. 将一个长的巴斯德吸管裹在纸巾上，并在锥形开始点的位置打破玻璃
3. 在本生灯泡中加热巴斯德吸管的破碎端，使其完全熔化。在用镊子或钳子夹住铂金线的同时，将铂丝线插入巴斯德吸管的熔化端（通常两者都在本生灯火焰中）
4. 从火焰中取出并让玻璃冷却。铂线的末端可以根据需要变扁和成型
四环素原料
1. 将12.5 mg / ml四环素溶于70％乙醇和30％蒸馏水中
2. 用150 ml或500 ml PES-膜过滤器过滤，并带有独立的底部容器
3. 用铝箔包装底部过滤器容器，以保护四环素溶液免受光照。在-20°C储存六个月以上
氯霉素股票
将34 mg / ml氯霉素溶于100％乙醇中在-20°C储存六个月以上
卡那霉素库存
将25 mg / ml卡那霉素溶于蒸馏水中过滤灭菌并在-20°C储存六个月以上
胆固醇库存
将10 mg / ml胆固醇溶于100％乙醇中在室温下储存超过十二个月
具有热杀菌细菌的富含抗生素的PBS
无菌PBS补充：
2％青霉素/链霉素（100x原料）
25μg/ ml四环素（12.5mg / ml储备）
34μg/ ml氯霉素（34mg / ml储备）
50μg/ ml卡那霉素（50mg / ml储备）
0.2％normocin（来自500x股票）
10μg/ ml胆固醇（来自10mg / ml原料）
添加热灭菌的细菌使溶液呈淡白色（约50-200μl热杀菌细菌/ 2.5ml PBS溶液）
血红素氯化物库存
通过将13mg海明氯溶解在9.8ml水加0.2ml 5N NaOH中来制备2mM氯化高锰酸盐的新鲜溶液。每天准备新鲜
Hoechst 33342，钙黄绿素AM和同源二聚体乙炔的库存
1. 在DMSO中制备1.6mM的同源二聚体的股份。从-80°C光线保存，然后存放在-80°C
2. 在蒸馏水中制备10 mg / ml的Hoechst 33342储存液。从-80°C光线保存，然后存放在-80°C
3. 在蒸馏水中制备1.6mM钙黄绿素AM的原料。从-80°C光线保存，然后存放在-80°C
4. 为了产生40μl储备溶液，混合1μl乙二胺二聚体储备溶液（终浓度为40μg/ ml）; 8μlHoechst 33342储备溶液（2mg / ml终浓度）; 10μl钙黄绿素AM储备液（0.4mg / ml终浓度）; 3μlDMSO;和18μl蒸馏水。储存液可以保存在-20°C或-80°C的光线下
  注意：如果一个或多个污渍太微弱或明亮，则可以在储备溶液中调节浓度，同时降低或增加污渍溶剂（DMSO或水）。

致谢

该协议已经从Chaudhari等人，2016年改编。一些C。用于产生菌株ET507的线虫株由CGC提供，由NIH研究基础设施办公室（P40 OD010440）资助。这项工作得到NIH / NIGMS（R01GM074212）和NSF（MCB-1138454）授予E.T.K.的授权。

参考

Bertani，G.（1951）。关于溶菌发生的研究。 I.通过溶菌原大肠杆菌释放噬菌体的方式。 J Bacteriol 62（3）：293-300。

Chaudhari，SN，Mukherjee，M.，Vagasi，AS，Bi，G.，Rahman，MM，Nguyen，CQ，Paul，L.，Selhub，J.and Kipreos，ET（2016）。＆lt; a class = ke-insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27404357“target =”_ blank“>细菌叶酸提供了秀丽隐杆线虫的外源信号。细胞增殖。 Dev Cell 38（1）：33-46。

Hansen，D.和Schedl，T。（2013）。干细胞增殖与秀丽隐杆线虫的减数分裂命运决定。 Adv Exp Med Biol 757：71-99。

Kimble，J.和Seidel，H。（2013）。＆nbsp; ℃。线虫种系干细胞及其生态位。哈佛干细胞研究所。 1-12。

Strange，K.，Christensen，M.and Morrison，R。（2007）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17446899”目标=“_ blank”>秀丽隐杆线虫原代培养开发用于电生理，细胞生物学和分子研究的胚胎细胞。 Nat Protoc 2（4）：1003- 1012.

Sulston，J.和Hodgkin，J。（1988）。线虫秀丽隐杆线虫在：Wood，WB（Ed）。冷泉港实验室 587-606。

Zhang，S.and Kuhn，JR（2013）。＆nbsp; 细胞分离和培养。 WormBook 1-39。