材料和试剂

移液器提示
塑料培养皿（VWR，目录号：25384-326）
石蜡膜
1.5ml Eppendorf离心管（VWR，目录号：20170-355）
滤纸
蓝杵（DWK Life Sciences，Kimble，目录号：749521-1500）
比维埃（VWR，目录号：414004-051）
注射器过滤器，0.2μm孔径（VWR，目录号：28145-475）
注射器
拟南芥生态型哥伦比亚（Col-0）和突变体株系lhr1（ put3 ）
ScintiVerse TM BD Cocktail（Fisher Scientific，目录号：SX18-4）
Clorox Bleach
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
（2,4-二氯苯氧基）乙酸钠盐一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：D6679）
Kinetin（Duchefa Biochemie，目录号：K0905）
氢氧化钠（NaOH）
Murashige＆amp; Skoog基础盐混合物（PhytoTechnology Laboratories，目录号：M524）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
甲基紫精二氯化物水合物（Sigma-Aldrich，目录号：856177）
亚精胺（MP Biomedicals，目录号：02152068）
百草枯 - 甲基 - 二氯化物水合物（Sigma-Aldrich，目录号：313947）
注意：本产品已停产。
亚精胺三盐酸盐[甲基亚甲基-3H（N）]（PelkinElmer，目录号：NET522001MC）
Trizma ®基质（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
注意：本产品已停产。
种子灭菌方案（见食谱）
2,000x 2,4-D（9.05mM）（参见食谱）
2,000x激动素（1.86mM）（参见食谱）
愈伤组织诱导固体培养基（参见食谱）
愈伤组织诱导液介质（参见食谱）
½MS固体培养基（参见食谱）
½MS液体介质（见配方）
200μM非标准的C标记的PQ溶液（参见食谱）
2.04mM非标记的H标记的Spd溶液（参见食谱）
40.37μM非 3 H标记的Spd溶液（参见食谱）
解决方案1： 14 C标记的PQ溶液（参见食谱）
解决方案2： 14 C标记的PQ溶液（参见食谱）
解决方案3： 3 H标记的Spd溶液（参见食谱）
解决方案4： 3 H标记的Spd溶液（参见食谱）
解决方案5： 3 H标记的Spd溶液（参见食谱）
解决方案6： 3 H标记的Spd溶液（参见食谱）
1M Tris-HCl，pH7.5（参见食谱）
0.5 M EDTA，pH 8.0（参见食谱）
粗蛋白提取缓冲液（参见食谱）

设备

移液器
pH计
称重平衡
层流罩
搅拌酒吧
磁力搅拌器（VWR，型号：200小型搅拌器）
涡旋（Fisher Scientific，型号：Vortex-Genie 2）
闪烁计数器（Beckman Coulter，型号：LS-6500）
离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge ® 22R，目录号：368831）
分光光度计（Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec Plus，目录号：1702525）
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高压灭菌器

程序

愈伤组织细胞和植物幼苗的制备
1. 愈伤组织细胞
2. 植物幼苗
生成标准曲线
1. 标准曲线 14 C标记的PQ
  1. 用ddH 2 O进行50x和500x稀释的10μl溶液2（参见食谱）。
  2. 在1ml的ScintiVerse TM BD Cocktail中，加入0μl，25μl，125μl和250μl500x稀释的溶液，以制备具有0〜 nCi，0.1nCi，0.5nCi，1nCi放射性，并加入125μl和250μl50x稀释的溶液，分别制备具有5nCi和10nCi放射性的 C标记的PQ。 >
  3. 使用Beckman LS-6500闪烁计数器测量放射性，以生成标准曲线。 C标记的PQ。
  4. 执行3套本次测试以确保标准曲线的准确性（图2）。
    
    图2.放射性标记PQ和Spd的标准曲线的代表
2. 标准曲线 3 H标记Spd
运输测定
1. 运输测试与愈伤组织（表1）
  
  表1.在愈伤组织细胞运输测定中使用的设计温度和Spd或PQ浓度
  1. 将100毫克新鲜的愈伤组织细胞转移到含有950微升液体愈伤组织诱导培养基的1.5ml Eppendorf离心管中，并旋涡30秒。
  2. 在设计温度下预处理样品30分钟以达到平衡（Shen等人，2016）。
  3. 根据处理条件将50μl溶液2（10μM的最终PQ浓度），溶液3（2μM的最终Spd浓度）或溶液4（最终Spd浓度在100μM）（参见食谱）加入管中（见附注2）
  4. 短暂地涡流混合并将管返回设计温度。
  5. 孵育1小时，每15分钟用手轻轻倒转每个管，以重新悬浮细胞，并确保溶液中PQ或Spd的平衡。
  6. 将管立即放在冰上。
  7. 让愈伤组织沉淀下来，用移液管去除含有PQ或含Spd的液体愈伤组织诱导培养基。
  8. 在冰上洗涤愈伤组织细胞5次，每次1.5ml预冷液体愈伤组织诱导培养基。对于每个处理，应同时使用三个重复样品。
2. 带幼苗的运输测定（表2）
  
  表2.植物幼苗运输测定中使用的设计温度和Spd或PQ浓度
细胞内含量的提取
1. 通过在冰上使用1ml（用于愈伤组织细胞）或500μl（用于幼苗根）粗蛋白质提取缓冲液（参见食谱）的小蓝杵研磨洗涤的愈伤组织细胞或幼苗根，直至不存在团块以释放所有细胞内内容物。该溶液应均质化成均匀的混合物，可以移液而无堵塞。
2. 在15℃下以15,500 x g离心混合物20分钟。
3. 将上清液转移到新的管中进行放射性和蛋白质浓度测量
4. 使用Bio-Rad SmartSpec Plus分光光度计测量每个样品的上清液的UV吸收值为300μl（对于愈伤组织细胞）或100μl（用于幼苗根）。然后使用以下等式，基于UV吸光度计算总蛋白浓度：
  
  蛋白质浓度（mg / ml）=（1.55×A280） - （0.76×A260）
放射性测量
1. 向每个样品的上清液中加入300μl（用于愈伤组织细胞）或100μl（作为幼苗根），加入1ml ScintiVerse BD Cocktail溶液中。
2. 使用Beckman LS-6500闪烁计数器测量每个样品的放射性

数据分析

基于闪烁计数器读数（CPM）和相应标准曲线的方程计算每个样品的放射性（nCi）。然后基于运输测定溶液中的放射性和每nmol使用的nCi计算每个样品中运输的PQ / Spd的总量。基于蛋白质浓度和体积计算每个样品的总蛋白。 PQ / Spd传输速率以每小时每克蛋白质的μmolePQ / Spd单位（μmoleg 1 h -1）表示。每个样品0℃的PQ / Spd传输速率被认为是PQ / Spd的非特异性结合，因此从25℃的PQ / Spd传输速率中减去，以计算调整和准确的PQ / Spd传输正常情况下的率。读者参考Shen <等等。（2016），了解数据图表的例子。

笔记

我们通过每3周将新鲜和快速生长的愈伤组织细胞转移到新的愈伤组织诱导培养基来维持愈伤组织细胞。通过判断愈伤组织细胞的颜色和生长，容易选择愈伤组织细胞进行转移。新鲜的愈伤组织通常显示浅色，而相对老的愈伤组织显示深色。
2μMSpd被设计用于测试转运蛋白是否是高亲和力PA转运蛋白，而100μMSpd被设计用于测试其他转运蛋白是否也以高Spd浓度工作。在我们的测试中，与野生型相比，在2μMSpd摄取速率下，put3突变体的愈伤组织细胞和幼苗分别显示约20倍和4倍的降低。然而，当将较高浓度（100μM）的Spd加入到培养基中时，在put3突变体和野生型之间的转运率是相当的。这可能表明PUT3蛋白是高亲和力PA转运蛋白，一些低亲和力PA转运蛋白可能开始在高PA浓度下工作。
在带有幼苗的运输测定中，我们使用150 x 15 mm培养皿，并将滤纸配件放入培养皿中。幼苗相对分开排列。

食谱

种子灭菌解决方案
25％Clorox Bleach
0.05％Triton X-100
在室温下存放
2,000x 2,4-D（9.05mM）
26mg（2,4-二氯苯氧基）乙酸钠盐一水合物
将ddH 2 O加入到11ml中并通过注射器过滤器（0.2μm）过滤灭菌
储存于-20°C
2,000x激动素（1.86 mM）
10mg激动素
1毫升1N NaOH 将ddH 2 O加入25ml，并通过注射器过滤器（0.2μm）过滤灭菌
储存于-20°C
愈伤组织诱导固体培养基
4.33 g / L Murashige＆amp; Skoog基础盐
3％蔗糖
用0.1N NaOH将pH调节至5.7，并加入琼脂至0.7％（w / v）高压灭菌器
冷却至〜60°C
添加2,4-D至最终浓度为4.52μM
将Kinetin添加至0.93μM的终浓度
在室温下存放
愈伤组织诱导液体培养基
4.33 g / L Murashige＆amp; Skoog基础盐
3％蔗糖
用0.1N NaOH调节pH至5.7，高压釜
冷却至〜60°C
添加2,4-D至最终浓度为4.52μM
将Kinetin添加至0.93μM的终浓度
在室温下存放
½MS固体培养基
2.17 g / L Murashige＆amp; Skoog基础盐
1.5％蔗糖
用0.1N NaOH将pH调节至5.7，并加入琼脂至1.2％（w / v）高压灭菌器
在室温下存放
½MS液体介质
2.17 g / L Murashige＆amp; Skoog基础盐
1.5％蔗糖
用0.1N NaOH调节pH至5.7，高压釜
在室温下存放
200μM非 14 C标记的PQ溶液
5.14毫克甲基紫精二氯化物水合物
100ml ddH 2 O 储存于-20°C
2.04mM非标记的H标记的Spd溶液
3.20微克亚精胺
10ml ddH 2 O O
储存于-20°C
40.37μM非 3 H标记的Spd溶液
198μl2.04mM亚精胺
9.8毫升ddH 2 O - / - 储存于-20°C
溶液1：C标记的PQ溶液（200μM，32.3nCi / nmol，15.55ml）
0.8毫克百草枯 - 甲基-C 14二氯化物
15.55ml ddH 2 O
储存于-20°C
溶液2：C标记的PQ溶液（200μM，10nCi / nmol，1ml）
309.6μl溶液1
690.4μl200μM非标准的C标记的PQ溶液
储存于-20°C
溶液3： 3 H标记的Spd溶液（40μM，500ntCi / nmol，1ml）
20μl亚精胺三盐酸盐，[末端亚甲基 - 3 H（N）] - 溶液
980μl40.37μM非 3 H标记的Spd溶液
储存于-20°C
溶液4： 3 H标记的Spd溶液（2mM，10nCi / nmol，1ml）
20μl亚精胺三盐酸盐，[末端亚甲基 - 3 H（N）] - 溶液
980μl2.04mM非标记H标记的Spd溶液
储存于-20°C
溶液5：H标记的Spd溶液（40μM，250ntCi / nmol，1ml）
500μl溶液3
500μl40μM非标记的H标记的Spd溶液
储存于-20°C
溶液6： 3 H标记的Spd溶液（2mM，5ntCi / nmol，1ml）
500μl溶液4
500μl2mM非标准H标记的Spd溶液
储存于-20°C
1M Tris-HCl，pH7.5
121.1g Trizma ® base
800毫升ddH 2 O
用浓HCl调节pH至7.5 将ddH 2 O加入到1000ml高压釜中在室温下存放
0.5 M EDTA，pH 8.0
186.1g乙二胺四乙酸二钠盐二水合物
800毫升ddH 2 O
用NaOH调节pH至8.0（约20g）将ddH 2 O加入到1000ml高压釜中在室温下存放
粗蛋白提取缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5）
0.1 mM EDTA
1mMβ-巯基乙醇
在室温下制作新鲜的溶液并储存

致谢

这项工作得到了美国农业部国家研究计划竞争力补助金2007-35100-18378美国部分支持。并由中国国家自然科学基金（批准号：31328004）提交给美国

参考

Gill，SS和Tuteja，N。（2010）。植物中的多胺和非生物胁迫耐受性。植物信号行为 5（1）：26-33。
Li，J.，Mu，J.，Bai，J.，Fu，F.，Zou，T.，An，F.，Zhang，J.，Jing，H.，Wang，Q.，Li， Yang，S.and Zuo，J。（2013）。＆nbsp; 百草枯抗性1，一种高尔基体定位的推定转运蛋白参与百草枯的细胞内运输。植物生理学162（1）：470-483。

Mulangi，V.，Chibucos，MC，Phuntumart，V.and Morris，PF（2012）。＆nbsp; 植物多胺摄取转运蛋白的动力学和系统发育分析。植物 236（4）：1261-1273。

Shen，Y.，Ruan，Q.，Chai，H.，Yuan，Y.，Yang，W.，Chen，J.，Xin，Z.和Shi，H。（2016）。拟南芥多胺转运蛋白LHR1 / PUT3调节热响应基因表达通过增强mRNA的稳定性。植物J 88（6）：1006-1021。

Uemura，T.，Kashiwagi，K。和Igarashi，K。（2007）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17218313”目标=“_ blank”>酿酒酵母中DUR3和SAM3的多胺吸收。生物化学282（10）：7733-7741。