材料和试剂

氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
Trizma碱（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
HEPES（GenScript USA，目录号：C01621）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
二甲基亚砜（DMSO）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D128）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
DBCO-S-S-PEG3 - 生物素结合物（点击化学工具，目录号：A112P3）
1,4-二硫苏糖醇，超纯（DTT）（Roche Applied Science，目录号：3117006001）
羟基甲基收集器（Active Motif，目录号：55013）
Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega Corporation，目录号：A1120）
10kDa Amicon Ultra-0.5ml离心过滤器（EMD Millipore，目录号：UFC501008）
QIAquick核苷酸去除试剂盒（QIAGEN，目录号：28304）
Micro Bio-Spin 6柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6222）
Dynabeads MyOne链霉亲和素C1（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：650-01）
Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
UltraPure琼脂糖（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：16500500）
β-葡萄糖基转移酶（β-GT）（New England Biolabs）
10xβ-GT反应缓冲液（见配方）
2x结合和洗涤（B& W）缓冲液（参见Recipes）
TE（参见配方）

设备

声处理装置（Covaris）
台式离心机
水浴（Thermo Fisher Scientific）
凝胶流动装置（Bio-Rad Corporation）
Nanodrop 1000（Thermo Fisher Scientific）
Labquake管振荡器（Barnstead/Thermolyne）
磁分离架（Promega Corporation，目录号：Z5342）
Qubit 2.0荧光计（Life Technologies，Invitrogen TM）

程序

根据不同的全基因组测序平台（通常超声到300 bp）将纯化的基因组DNA片段化成短片段。按照Covaris的手册设置300 bp的片段化程序。用于超声处理的DNA缓冲液可以是TE（10mM Tris pH 8.0,1mM EDTA），EB（10mM Tris pH8.5）或水。
使用100-bp DNA标记，验证片段化基因组DNA在2％琼脂糖凝胶上的大小分布。使用Nanodrop或通过荧光定量测定dsDNA的断裂后的DNA浓度，理想的浓度应高于600ng /μl。
如果需要，通过10kDa Amicon Ultra-0.5ml离心过滤器或乙醇沉淀来浓缩DNA。在使用Nanodrop浓缩后再次测量DNA浓度。

使用适当的起始DNA量，并根据以下条件（脑组织）设置反应

组件	音量	最终浓度
水	_μl
10xβ-GT反应缓冲液	2μl	1x
最多10μg基因组DNA	_μl	高达500 ng /μl
UDP-6-N3-Glc（3mM）	0.67μl	100μM
β-GT（40μM）	1μl	2μM
总量	20μl

通过吸移混合并在37℃水浴中孵育1小时。
用QIAquick核苷酸去除试剂盒清除反应，每个柱使用10μgDNA。用30μl水/柱洗脱并合并。
将10mg DBCO-S-S-PEG3-生物素缀合物溶解在384μlDMSO中以制备30mM储备溶液并储存在-80℃。用DMSO稀释储备溶液以制备4.5mM工作溶液并储存在-20℃。储存溶液在-80℃下稳定数年。工作溶液在-20°C稳定3个月。
将来自步骤6）的洗脱的DNA溶液中的DBCO-S-S-PEG3-生物素缀合物工作溶液加至终浓度为150μM（即每30μlDNA溶液中的1μl工作溶液）。
通过吸移混合并在37℃水浴中孵育1小时。
用QIAquick核苷酸去除试剂盒清除反应，每个柱使用10μgDNA。用每柱至少30μl水洗脱并合并。理想的组合洗脱体积为100μl，最大体积为150μl。
使用Nanodrop测量DNA浓度，计算DNA回收率。
用100μl1x B& W缓冲液按照其手册洗涤50μlDynabeads MyOne链霉亲和素C1三次。用磁力架分离珠子，并将珠子重悬在100μl的2×B& W缓冲液中。
从步骤11）保存10 ng DNA，将剩余的（100至150μl）加入来自上一步骤的重悬的珠子。
在室温下孵育15分钟，在Labquake管振荡器上轻轻旋转。
用磁力架分离珠子，用200μl1×B& W缓冲液洗涤珠子3次。
通过将珠子在50μl新鲜制备的100mM DTT中温育来洗脱DNA。在室温下搅拌2小时，在Labquake管摇动器上轻轻旋转。
用磁性支架分离珠子。吸出洗脱液并按照其说明将其装载至Micro Bio-Spin 6柱以除去DTT。
通过Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化来自上一步骤的洗脱的DNA，并在10μlEB缓冲液中洗脱DNA。使用Qubit荧光计定量DNA。该DNA准备用于下游全基因组测序文库制备。

食谱

10xβ-GT反应缓冲液
500mM HEPES（pH 7.9）
250mM MgCl 2
2x结合和洗涤（B& W）缓冲液
10mM Tris（pH7.5） 1mM EDTA
2 M NaCl
0.02％Tween 20
TE
10mM（Tris pH 8.0）
1mM EDTA

致谢

这里描述的协议改编自先前报道的一个（Song等人，2011）。

参考文献

Song，CX，Szulwach，KE，Fu，Y.，Dai，Q.，Yi，C.，Li，X.，Li，Y.，Chen，CH，Zhang，W.，Jian，X.，Wang，J （2011）的研究结果表明，该方法能有效地解决这一问题。选择性化学标记显示5-羟甲基胞嘧啶的全基因组分布。 Nat Biotechnol 29（1）：68-72。