材料和试剂

Scalpel刀片（ProSciTech，配置文件11）（Swann Morton，目录号：LSB11）
20×100mm细胞培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：353003）
棉花芽（Cotton Tips double ends，Protec Solutions，目录号：941001690389）
转移移液管（3 ml）（Interlab，目录号：KJ622-1A）
（Techno Plas，目录号：P5016UL）
40μm过滤器（Corning，Falcon ®，目录号：352340）
玻璃盖玻片（覆盖物＃1 30毫米直径）（PST，目录号：G430）
6孔组织培养板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：140675）
35×10毫米细胞培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：353001）
从新西兰国家眼库获得手术后新鲜和冷冻的人类尸体供体角膜巩膜组织
70％乙醇（EMD Millipore，目录号：1009832500）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）无菌（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
磷酸盐缓冲盐水和10％甘油（AnalaR NORMAPUR）（VWR，目录号：24388.320）
Dispase（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：17105041）
胶原酶（Blend Type L）（Sigma-Aldrich，目录号：C8176）
透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H3506）
Neurobasal-A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10888022）
人类表皮生长因子（EGF）（PeproTech，目录号：AF-100-15）
人成纤维细胞生长因子（FGF）基础（PeproTech，目录号：100-18B）
B-27 Supplement，50x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12587010）
N-2 Supplement，100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：17502048）
GlutaMAX，100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：35050061）
MEM与GlutaMAX（最低必需培养基）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：41090036）
胎牛血清（新西兰来源）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10091148）
抗生素/抗真菌剂100x（抗/抗）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15240062）
补充的Neurobasal-A培养基（见食谱）
标准培养基（参见食谱）

设备

组织文化罩（Heal Force，型号：HFsafe 1800）
直剪刀（世界精密仪器，目录号：500216）
精镊子（世界精密仪器，目录号：14142）
轨道摇床（Ratek Instruments，型号：MM1）
离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：3-15）
组织培养培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Hereaus TM HeraCell 150）
层流柜（Gelman，型号：HLF 120）
双目立体显微镜（Carl Zeiss，目录号：474110-9904）
生物安全柜（Email Air Handling，目录号：1687-2340-618-3）
2-20μlEppendorf ®移液器（Eppendorf，目录号：3120000038）
羽毛MicroScalpel（pfm medical，目录号：200300715）
新月斜角眼镜2.3毫米（MANI，目录号：MCU26）
NIKON数码摄像机DS-UI相机（尼康乐器，型号：DS-UI）
徕卡DMIL倒置对比显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DMIL）
徕卡DM-RA立式荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：徕卡DM-RA）

软件

NIS-Elements Br显微镜成像软件3.0版

程序

注意：此过程已在实验室（Yoon等人，2013）的以前工作中进行了描述，但以下部分提供了有关过程的其他信息，并以协议格式描述了该技术。

球体形成与文化（视频1）

Video 1. Corneoscleral tissue processing for Sphere Forming Assay. Corneoscleral tissue is rubbed with a cotton bud on the posterior side to remove endothelial cells, scraped on the anterior side to remove epithelial cells and washed in PBS. The corneal/limbal region is excised and cut into small pieces prior to enzymatic treatment for limbal cell isolation.
1. 在无菌组织培养罩中使用无菌技术，制备1个容器的70％乙醇和1个容器的PBS用于工具和1个容器的PBS用于洗涤。将直剪刀，手术刀刀片和镊子放在70％乙醇中10分钟
2. 从70％乙醇中取出上述设备，并在无菌PBS中短暂冲洗以除去残留的乙醇
3. 使用镊子将角膜巩膜组织放入100毫米无菌培养皿（角膜巩膜边缘[图1A]）具有大约2-2.5毫米宽的角膜/角膜缘组织环，当切除时具有55-57毫克的近似湿重）。
4. 使用无菌棉花芽，擦拭角膜组织的后表面以去除内皮细胞（图1B）
5. 使用新月形斜角眼刀，轻轻擦拭组织的前表面以去除上皮细胞（图1C）。
6. 使用无菌转移移液管，用PBS清洗组织。重复上皮刮擦并洗涤直到PBS洗涤清除细胞碎片（图1D）。
7. 消除角膜缘区域并排除尽可能多的巩膜（图1E）。冲洗切除的角膜缘，用剪刀切碎组织（图1F），放入无菌的5ml管中。
  
  图1.球形成测定的角膜巩膜组织处理角膜巩膜组织（A）在后侧用棉花揉搓以去除内皮细胞（B），在前侧刮去以去除上皮细胞（C）并在PBS（D）中洗涤。切割角膜缘（E）并切割成小片（F），然后进行角膜缘细胞分离的酶处理。
8. 在1.2U / ml分散液中于37℃孵育40分钟。
9. 在37℃，在轨道振荡器上，用抗/抗体在MEM中以2mg / ml胶原酶和0.5mg / ml透明质酸酶孵育过夜。
10. 使用40μm过滤器将溶液和细胞溶解，以除去未消化的物质
11. 将滤液在405g离心滤液7分钟，并用PBS洗涤细胞沉淀
12. 将细胞悬浮于2ml补充的Neurobasal-A培养基中
13. 在6孔组织培养板中制备无菌玻璃盖玻片。
14. 将2ml悬浮液均匀地种植到孔中
15. 在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中培养细胞。
16. 从表面小心地更换50％的培养基每周两次移液，以避免移除细胞或新形成的球体
17. 细胞常常粘附在玻璃盖玻片上并聚集成球形结构（图2）
  
  图2.球形形成。相位显微镜显示在接种后最初粘附到玻璃盖玻片上的分离的细胞（A），其在几天至几周的过程中聚集并形成球状结构（B）。比例尺= 100μm。
用于球体植入的组织的制备
1. 在生物安全柜（Heal Force Model HF-safe 1800）的无菌条件下，供体角膜巩膜边缘在-80°C储存3个月以上，分为1/8 储存在单独的5ml容器中并在-80℃下再冷冻。
2. 每个角膜巩膜边缘经受总共3次冻融循环，以便在用于植入之前使组织脱细胞。
  注意：如果需要完全去细胞化，可以根据制造商的指示，使用标准培养基中的LIVE / DEAD 2 /μ2钙钙荧光素AM和4μM乙二胺二聚体-1（Life Technologies）确认完全脱细胞化或确定需要额外的冻融循环。
角膜缘显微外科（视频2）

Video 2. Surgical excision of a wedge of limbal tissue. Fine forceps were used with the non-dominant hand to anchor the sclera and provide counter-traction as two diagonal ~3 mm incisions were made prior to gripping the apex of the incised tissue to cut away and remove the anterior tissue segment. Cornea-limbus-sclera demarcations have to be visually approximated.
1. 在层流柜（Gelman model HLF 120）中使用无菌技术，制备1个容器的70％乙醇和1个容器的无菌PBS用于工具。
2. 将精镊子和MicroScalpel刀片放入乙醇中放置10分钟
3. 取出解冻的角膜缘缘并放入培养皿中
4. 在PBS中洗涤工具后，使用双目立体显微镜观察角膜缘。
5. 使用MicroScalpel，使两个对角线〜3mm的切口（图3A）进入角膜缘，顶点相交，从而形成三角形楔形物（图3B和3C）。使用细镊子抓住顶点的组织并提起楔子（图3D）。
  
  图3.角膜缘组织的手术切除使用非优势手使用精细镊子锚固巩膜，并提供反向牵引，因为两个对角线〜3mm的切口（A）正在（B，C），然后握住顶点以切除切开的组织（D）。角膜缘 - 巩膜分界必须视觉近似。
6. 使用羽毛MicroScalpel切割锚定组织，同时向前倾斜刀片，使得创建的凹陷在角膜方向较浅（图4）。
  
  图4.楔形组织的移除从角膜缘区域切除（B）后产生的楔形物（A）的向上倾斜的地板的3-D表示。
7. 重复以在组织中创建额外的切口。
  注意：切割的可视化最初对未经训练的眼睛具有挑战性，但会随着实践而发展。良好的照明将会有所帮助。
8. 培养皿关闭，将组织转移到II类生物安全柜。
球体植入
1. 使用无菌棉花芽，首先将过量的液体从已经形成角膜缘楔形切口的角膜巩膜组织中吸出。
2. 球体可以在II类生物安全柜内的双目立体显微镜下观察。
3. 使用无菌2-20μlEppendorf ®移液器设置为5μl的体积，轻轻吸取培养物中的球体。
4. 可视化角膜巩膜组织中的切口，将球体和介质推入楔形切口。
  注意：尽可能地尽可能地排出培养基体积，同时确保球体被排出。偶尔会出现球体浮出组织的困难，如果球体植入，特别是球形从微量移液器喷出，则不会轻轻地进行。
5. 将角膜巩膜边缘用植入的球体转移到35×10 5细胞培养皿中，并在室温下孵育15分钟上皮侧。
6. 反转组织使上皮面朝下。
  注意：通过个人经验，翻转组织已被证明比右侧培养组织更好，因为角膜通常漂浮，球体不完全浸没在培养基中，这似乎不利于细胞迁移和存活。然而，使用倒置培养物，球体有时不会留在原位，并从组织中脱离出来。
7. 轻轻地用2ml标准培养基覆盖组织。
8. 每隔一天进行一次中等的变化。
  以下图像面板和图例已从Mathan等人复制。（2016）（图5）
  
  图5.将外周角膜球植入供体角膜巩膜边缘将球体（箭头）植入在角膜缘区域形成的楔形切口中。在立体显微镜下，可以清楚地看到具有切口（箭头）和植入的球体的角膜巩膜边缘（A）。组合相差和荧光显微镜显示用LIVE / DEAD染色（B）对活细胞染色的植入球体。该信号被限制在球体上，在周围组织中不被检测。冷冻储存的角膜巩膜边缘的40倍DAPI染色的10μm厚的横截面证实在植入之前不存在DAPI阳性细胞核（C）。通过相差显微镜，显示球体在组织半透明区域的位置（D）。刻度棒=500μm（A），100μm（B和D），50μm（C）。

数据分析

为了评估球体和植入的细胞在组织中的活力，使用标准培养基中的LIVE / DEAD 2μM钙黄绿素AM和4μM乙锭同二聚体-1（Life Technologies）。
使用NV6双目立体显微镜（Carl Zeiss）评估的亮场图像使用NIKON Digital sight DS-UI相机（NIKON CORPORATION，Tokyo，Japan）捕获。使用以下显微镜进行相差和荧光显微镜：Leica DMIL倒置对比显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany），4倍放大0.1孔，C PLAN与Leica Application Suite V4.0.0 Build 454;和Leica DM-RA立式荧光显微镜（Leica Microsystems），5倍放大率0.15孔径，HC PL Fluotar和40倍放大倍数，1.00孔径，PL FLUOTAR油PH3与NIS元件Br显微镜成像软件3.0版和图像捕获使用NIKON数字DS-UI摄像机（NIKON）。
以下图像面板和图例已从Mathan等人复制。（2016）（图6）

图6.植入角膜巩膜组织的外周角膜球重新植入眼表。植入球后5x放大，植入后0小时的LIVE / DEAD ®染色（绿色） A）和植入后4天（B），显示从球体出现的绿色条纹的细胞迁移。在植入后7天（C），整个角膜床似乎与活细胞重新填充。在角膜表面（D）的前导迁移边缘处的代表性细胞和从图C（E）中由单个星号表示的区域取得的角膜表面上的细胞显示不同的形态。代表性细胞超过角膜缘区域（F）和巩膜（G）（分别由双星和三星号表示的区域）显示与角膜组织中观察到的不同的细胞迁移模式和形态。刻度棒=1,000μm（A，B，E）。刻度棒=100μm（C，D，F，G）。

食谱

补充的Neurobasal-A培养基补充有2ng / ml EGF，1ng / ml FGF，1/50B27,1 / 100N2，2μg/ ml肝素和2mM GlutaMAX 的神经巴巴-A培养基
标准培养基
MEM（1x）补充有10％胎牛血清和1/100抗/抗
的GlutaMAX

致谢

作者要感谢组织捐赠者及其家属对科学研究的特别礼物。他们还要感谢Dipika Patel副教授对外科手术的帮助。本研究中提供的工作由奥克兰的赠款资助。
医学研究基金会[1111010]，拯救视力社会[3622588]，奥克兰医学院PBRF补助金以及医学和健康科学学院夏季奖学金奖和约翰·哈默尔麦克格雷戈奖。

参考

Mathan，JJ，Ismail，S.，McGhee，JJ，McGhee，CN和Sherwin，T。（2016）。

Yoon，JJ，Wang，EF，Ismail，S.，McGhee，JJ和Sherwin，T。（2013）。＆nbsp;