材料和试剂

移液头（Corning，Axygen ®，目录号：TF-300-R-S，TF-200-R-S和TF-1000-R-S）
文化管（Borosil，目录号：9800U06）
培养皿（Tarson Products，目录号：460140-140MM）
Stericup ®孔径为0.22μm的过滤单元（EMD Millipore，目录号：SCGPU02RE）
离心管：500ml，50ml，15ml，2ml和1.5ml（Tarson Products，Kolkata，India）
软木蛀虫8±0.2毫米（HiMedia实验室，目录号：LA737）
注射器驱动的具有0.22μm孔隙率的过滤器单元（Millex -GS）（EMD Millipore，目录号：SLGS033SS）
黄单胞菌（Xanthomonas campestris） pv。 campestris 8004，X。 oryzae pv。 oryzicola BXOR1，X。 oryzae pv。 ae ae ae ynthesis基因A（实验室收集）
利福平
2,2'-联吡啶（DP）（Sigma-Aldrich，目录号：14453）
注意：本产品已停产。
Amberlite XAD16N，20-60目（Sigma-Aldrich，目录号：XAD16-1KG）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32407）
标准弧菌素（Fujita等人，2011;见注2和3）
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6508-25ML）
乙腈（CH 3 CN）（Sigma-Aldrich，目录号：34888-1L）
注意：本产品已停产。
蛋白胨（HiMedia Laboratories，目录号：CR001）
蔗糖（HiMedia Laboratories，目录号：GRM601-500G）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
Chrome Azural S（CAS）（默克，目录号：1.02477.0025）
氯化铁（FeCl 3）（标准试剂，目录号：SRCF005C）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：29507）
十六烷基三甲基溴化铵（HDTMA）（Sigma-Aldrich，目录号：H6269-250G）
Bacto TM琼脂（BD，Bacto TM，目录号：214010）
Bacto TM 蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211677）
琼脂（HiMedia Laboratories，目录号：RM026-500G）
蛋白胨 - 蔗糖（PS）培养基（Tsuchia等人，1982;见食谱）
CAS解决方案（Schwyn and Neilands，1987; see Recipes）
胨 - 蔗糖 - 琼脂（PSA）培养基（见食谱）
PSA-CAS-DP板（参见食谱）

设备

锥形瓶：500ml（Vensil Glass Works，目录号：1161）
锥形瓶：2,000毫升（Borosil，目录号：4980030）
微量移液器（Eppendorf，目录号：EPPR4396）
振荡孵化器（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® 43）
SORVALL RC-5B PLUS超速离心机（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
pH计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：EC-PH510 / 11S）
Agilent 1100系列HPLC系统（Agilent Technologies，型号：Agilent 1100系列）
Agilent C-18（4.6 mm x 250 mm x 5μm）色谱柱（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）
滴定管（BOROSIL，目录号：2123016），滴定管支架和夹具
真空浓缩机加（Eppendorf，型号：Concentrator Plus，目录号：5305000304）
Millipore真空，压力泵（EMD Millipore，目录号：XI04 220 50）
高压灭菌器

软件

化学工作站软件; Rev. A.10.02 [1757]（Agilent，Santa Clara，CA，USA）
Microsoft Office Excel 2013（Microsoft Corporation，Redmond，USA）

程序

无细胞培养上清液的制备
1. 在含有利福平（50μg/ ml）的PSA板上，从其甘油储备液中分离细菌菌株，并在28℃的静态培养箱中孵育2-3天。为了开始初级培养，将单个菌落从上述板转移到含有3ml新鲜PS培养基（参见食谱）的高压灭菌培养管中，其中利福平（50μg/ ml）。黄单胞菌属的主要培养物可以在振荡培养箱中在28℃和200rpm下生长至晚指数生长（OD 600〜1.0），持续16-20小时。
2. 通过使用从上述原代培养物中的0.2％接种物（2ml）开始二次培养，加入补充有适量2,2' - 联吡啶（150μM， pv. campestris str。8004,100μM用于米曲霉米曲霉，50μM用于米曲霉oryzicola）。在28℃的培养箱中以200rpm的振荡孵育第二培养物48小时。
3. 在4℃下以17,000×g离心细菌培养物1小时以沉淀细胞和外多糖。
4. 为了从上清液中除去剩余的细胞，用Stericups（孔径0.22μm）和真空压力泵过滤上清液。
5. 用浓HCl（6N）将pH调节至2.0，以降低铁载体在水中的溶解度（Rey等，1996）。
使用XAD-16树脂柱的色谱柱
1. 通过装入220g Amberlite XAD-16聚合物树脂制备2.4×30cm柱。
  注意：在需要色谱柱前一天，将水浸泡过夜，以准备Amberlite树脂。
2. 用两倍的床体积（440ml）的甲醇洗涤填充柱，并平衡柱体积为三倍体积（660ml）的无菌MilliQ水。
3. 将无细胞细菌上清液（方法A;步骤A5）通过平衡的XAD-16树脂柱（见注7）。
4. 用200ml甲醇洗脱，并在2.0ml离心管中收集约100个级分（约2ml）（见附注7;图1）。
  
  图1. Xad-16树脂柱（在滴定管中制备），带有滴定管支持设备，用于收集黄腐败铁载体的洗脱液的不同部分
CAS平板测定
1. 准备PSA-CAS-DP板（参见食谱）。
2. 用无菌软木钻孔器在板上打几个孔，保持孔间距离约2.5厘米。
3. 将大约250μl的每个级分（根据洗脱顺序，程序B;步骤B4）放入分开的孔中，将盖直立放置在顶部，并在28℃下在静态培养箱中孵育。
4. 24小时后观察分数的活度。
5. 特征的黄色晕圈（光环13-24）表示铁载体的存在，而蓝色和红色的晕圈（光环1-12）表示有机酸的存在（图2）。
  
  图2.具有多个孔的PSA-CAS-DP板，其表现出与洗脱液的不同部分（由XAD-16树脂柱分离）孵育24小时后形成的不同着色晕圈，用于从X离子铁载体分离。 oryzae pv。蓝色和红色晕圈（光环1-12）表示含有机酸的级分，而黄色光环（卤素13-24）表示含有黄铁腐体铁载体的级分。
  注意：
  1. 我们还没有将第二十四分之二的铁载体洗脱液用于HPLC运行。因为我们已经观察到，与在其它杂质的存在相比，存在于这些级分中的铁载体可以忽略不计，在HPLC运行期间产生更多的噪声。添加这些用于HPLC的片段与活性片段一起（第13-20）将使杂质水平增加到更大的程度，而不显着增加样品中铁载体的总量。注意，学生的t检验（配对）用于分析针对HPLC运行的主要活性成分（第13至20号）中这些级分对杂质水平和铁载体量的贡献程度。
  2. 为了最小化由于对应于光晕21-24的部分中存在的其他不需要的成分引起的干扰程度（在加热和试验方法之后），只有对应于光晕13-20的铁载体的活性部分应当从各自剩余的主要库存（每个约1.75毫升）中进行HPLC定量。
HPLC定量＆nbsp;
1. 从程序B中汇集所有活性级分（对应于光晕13-20）;步骤B4进入在PSA-CAS-DP板上显示特征性黄色晕圈的15ml离心管（方法C;步骤C5）。
2. 为了除去溶剂，使用真空浓缩器（在酒精模式30℃下）将样品完全干燥。
3. 用1ml甲醇重建，用孔径0.22μm的注射器驱动的过滤器过滤
4. 注射每个菌株的推荐体积的过滤样品（25μl，用于刺激野生乳杆菌），10μl用于X，oryzae pv。oryzicola和X 。oryzae pv。oryzae）进入Agilent 1100系列HPLC系统（图3A-3B）。
5. 使用梯度：使用Agilent C-18柱（4.6mm×250mm×5μm）进行分离：A = H 2 O / 0.1％TFA，B = CH 3 CN / 0.1％TFA; 10分钟内为0-30％B，15分钟为30-45％B，20分钟为45-0％B，流速为1 ml / min。
6. 制作标准曲线，绘制趋势线，并从已知量的弧菌素（Fujita等人，2011）或黄高铁蛋白与通过HPLC色谱图获得的各自的峰面积获得等式（使用Microsoft Excel）（参见注1，2和3）。
7. 从标准的弧菌铁蛋白或黄高铁蛋白得到的公式计算黄铁烷铁载体（存在于未知样品中）的量。
  
  图3. HPLC程序和仪器。 A.化学工作站软件中的HPLC程序; Rev. A.10.02 [1757]。 B.一部分HPLC机器，指示样品取向和自动注射针。＆nbsp;

数据分析

将样品（程序D;步骤D5）和空白（XAD-16树脂柱的空缓冲液洗脱液）的HPLC HPLC信号加载到ChemStation软件的离线模式。从样品信号中减去空白信号，然后自动积分，自动识别峰。记录对话框中生成的RT（保留时间）值和峰值区域。可以观察到纯黄素铁蛋白信号，同时监测来自黄单胞菌属（Xenonmonmonasas）的SSX突变体的分离的铁载体的HPLC色谱图中的缺失峰。与其各自的野生型相比。从黄烷铁蛋白的活性级分中，可以分离纯化的级分，真空干燥，称重并用作“标准黄高铁蛋白”，通过采用HPLC运行的不同已知量绘制标准曲线。通过绘制各个HPLC运行后获得的“相对于平均峰面积”绘制黄铁蛋白的标准曲线（图4）。使用标准曲线确定未知样品黄高铁蛋白铁载体的量。验证差异中的显着性水平，如果两个不同组所获得的数据之间存在任何差异，则使用配对的Student's 测试。
注意：对于一组实验，至少需要三次独立的生物重复。

图4. Xanthoferrin标准曲线;显示用于描绘HPLC运行中使用的铁载体量用于获得各个峰值区域的方程

笔记

可以使用ΔxSA突变体作为阴性对照。在ΔxssA突变株中，黄曲霉素峰将不存在或显着降低。对应于从ΔxssA突变体（Pandey等人，2016a）分离的铁载体的HPLC色谱图的缺失峰，可以从野生型菌株中收集纯黄高铁蛋白并用作标准。
虽然可以通过称重干黄素铁蛋白直接测定铁载体的质量，但优选为大量样品（> 5）创建标准曲线。
由于我们在300nm（保留时间〜11分钟）时检测到铁（III） - 亚铁铁氰酸盐络合物，所以预期分离的黄铁锈铁铁载体主要作为铁铁载体配合物存在。因此，优选使用铁铁载体络合物（1:1比例）制备标准曲线。
细菌接种和CAS平板测定应在无菌条件下进行
由于长期储存和频繁的冻融循环可能导致黄铁烷铁载体的降解，因此可以在4℃下储存最多1周。
2,2'-联吡啶的浓度可能稍微变化（高达±25μM），这取决于介质组分中作为杂质的铁的可用性。
柱制备和色谱法应在室温下进行。色谱步骤（洗涤，平衡和洗脱）应通过重力流程进行。

食谱

胨 - 蔗糖（PS）培养基 1％蛋白胨（w / v）
1％蔗糖（w / v）
在MilliQ水中溶解上述试剂用3N氢氧化钠将pH调节至7.4，在121℃和15psi下高压灭菌20分钟
CAS解决方案

0.06克铬Azurol S染料在50ml MilliQ水中
Fe（III）溶液：10 ml
1mM FeCl 3
10 mM HCl
0.072g HDTMA在40ml MilliQ水中
将所有三种溶液分别混合，然后混合在一起，在121℃和15psi下高压灭菌20分钟以消毒

胨 - 蔗糖 - 琼脂（PSA）培养基
1％Bacto TM 蛋白胨（w / v）
1％蔗糖（w / v）
在MilliQ水中溶解上述试剂，用3N氢氧化钠将pH调节至7.4，加入1.4％Bacto TM琼脂（w / v;最终），并在121℃和15psi下高压灭菌20分钟< br />
PSA-CAS-DP板（140mm板）
60 ml熔融PSA
2,2'-联吡啶基（75μM，野草莓，野菜），50μM用于米曲霉或米曲霉和米曲霉X，oryzae pv。oryzicola）
7.2 ml CAS溶液

致谢

我们承认Masaki J. Fujita博士（日本北海道大学）为本研究提供纯的弧菌素。我们从实验室（Rai，2015年）向以前的研究提出了确认，从那里我们修改了Xcc的铁载体估计协议。这项工作得到了DBT印度，CSIR-HRDG-印度，DST-SERB-印度和CDFD核心资金的SC的资助。 SSP是来自CSIR印度的JRF和SRF的接收者。 PS和BS是UGC-India的JRF和SRF的接受者。 RKV是DBT-India的JRF和SRF的接收者。

参考

Fujita，MJ，Kimura，N.，Sakai，A.，Ichikawa，Y.，Hanyu，T。和Otsuka，M。（2011）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22146715“target =”_ blank“>来自海洋宏基因组文库的弧菌铁蛋白生物合成基因簇的克隆和异源表达 Biosci Biotechnol Biochem 75（12）：2283-2287。
Neilands，JB（1995）。＆nbsp; 铁载体：结构和功能的微生物铁转运化合物。 J Biol Chem 270（45）：26723-26726。
Pandey，A.和Sonti，RV（2010）。＆nbsp; FeoB蛋白和铁载体在促进霉菌黄杆菌的毒力中的作用 pv。米饭上的米曲霉。 J Bacteriol 192（12）：3187-3203。
Pandey，SS，Patnana，PK，Lomada，SK，Tomar，A.和Chatterjee，S.（2016a）。铁和XibR的铁代谢和毒力相关功能的协调调节，一种新型的铁结合转录因子，在植物病原体黄单胞菌中。 PLoS Pathog 12（11）：e1006019。

Pandey，SS，Patnana，PK，Rai，R。和Chatterjee，S.（2016b）。

Rai，R.，Javvadi，S。和Chatterjee，S。（2015）。细胞信号传导促进黄单胞菌黄单胞菌中的铁铁摄取。有利于其在水稻中的毒力和生长的谷朊病毒。分子微生物 96（4）：708-727。

Rey，F.，Ferreira，MA，Facal，P.和Machado，AASC（1996）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139 /v96-033#.WVNsA2iGNdg“target =”_ blank“>浓度，pH和离子强度对土壤富里酸溶液粘度的影响。 Chem J Chem 74： 295-299。

Schwyn，B.and Neilands，JB（1987）。＆nbsp; 用于检测和测定铁载体的通用化学测定。 Anal Biochem 160（1）：47-56。

Tsuchia，K.，Mew，TW和Wakimoto，S。（1982）。野毒型和诱导的黄单胞病毒Xanthomonas campestris突变体的细菌学和病理学鉴定。 oryzae。植物病理学 72：43-46。