材料和试剂

250μl移液器吸头（Mettler-Toledo International，Rainin，目录号：17007479）
1 ml移液器吸头（Mettler-Toledo International，Rainin，目录号：17001121）
50ml SuperClear离心管（Labcon，目录号：LAB3181）
滤纸（Advantec，No.1：90 mm）
培养皿，圆形，90 x 15毫米（Alpha Plus，目录号：16001-1）
50ml注射器（Sigma-Aldrich，目录号：Z124990）
注射器过滤器（VWR，目录号：89041-306）
Micropore磁带（3M，目录号：1530-0）
1毫升管子
水稻种子：Orysa sativa spp。 cv。 Hwayoung和OsBUL1 敲除突变体水稻（ osbul1 ）
乙醇（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{®，目录号：8006）}
次氯酸钠（NaOCl，商业漂白剂CLOROX）
吐温20（Alfa Aesar，Affymetrix / USB，目录号：J20605）
氢氧化钾（KOH）（SHOWA，目录号：1637-0150）
Murashige＆amp;具有维生素（MS）的Skoog基础培养基（PhytoTechnology Laboratories，目录号：M519）
蔗糖（Alfa Aesar，Affymetrix / USB，目录号：J21938）
植物凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：P8169-500G）
油菜素内酯（BL）（Sigma-Aldrich，目录号：E1641）
次氯酸钠溶液（最终有效氯含量为2％）（见配方）
5 N氢氧化钾（KOH）溶液（见配方）
Murashige＆amp; Skoog（MS）媒体（见配方）
1毫升芥子苷（BL）储备溶液（参见食谱）

设备

稻壳（KETT ELECTRIC LABORATORY，型号：TR-130）
超声波清洗机（Elma，型号：E-30H）
洁净台（Chu-An，型号：MBH-420N）
剪刀（基本寿命，目录号：76000）
镊子（基本寿命，目录号：BL6502）
生长室（长康，型号：CK-68EX）
数码相机（索尼，型号：NEX-3N）
量角器（台湾联合文具，产品编号：HA401）
600ml烧杯（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 106 48）
玻璃培养皿（Sun Chion，目录号：B16A1-0090）
高压灭菌器
10 ml量筒（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 390 08 04）
100ml量筒（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 390 24 02）
500 ml量筒（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 390 44 03）
涡旋混合器（Vortex-Genie2，Scientific Industries，型号：Model G560）
孵化器（YIHDER TECHNOLOGY，型号：LM-570RD）
Pipetmans（Gilson，型号：P20，P200和P1000）
基础16水净化系统（EMD Millipore，型号：RiOs ^{TM Essential 16）}
峰会系列分析天平（丹佛仪器，型号：SI-234）
pH计（UltraBasic台式pH计，丹佛仪器，型号：UB-10）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）用于层板角度测量

程序

幼苗倾斜准备
1. 表面灭菌水稻种子
  1. 使用稻壳去除种子的外a和内ker（图1）
    
    图1.稻壳使用
  2. 将50-60个裸露的种子放入50 ml SuperClear离心管中，用30 ml的70％乙醇对种子表面灭菌1 min，用手大力摇动。
  3. 用30毫升无菌水冲洗种子，倒掉脏液体。
  4. 加入30 ml的2％次氯酸钠溶液（参见食谱），并将管置于超声波清洗机中20分钟。
  5. 弃去次氯酸钠溶液，并在清洁工作台上用30 ml无菌水冲洗种子。我们通常重复洗涤过程10-15次。
  6. 将种子放在高压灭菌的滤纸上干燥，然后使用无菌镊子将20个种子转移到含有MS培养基的烧杯中（参见食谱）。
2. 长时间（16小时光照）在28℃下将生长室内的灭菌种子发芽8天。
3. 通过将含有第二叶片叶片和叶鞘的大约2cm的片段（图2）切除样品均匀的幼苗（基于每个基因型中相似的高度），并将其移至无菌水上10分钟，然后将其转移到BL解决方案
  
  图2.用于叶片倾斜测定的八日龄水稻幼苗将WT（Hwayoung栽培品种）和osbul1突变体水稻生长在含有MS培养基的烧杯（左）中。含有水稻幼苗第二叶片接头的叶片用虚线标示，用于层板倾斜测定。
外源性BL治疗
1. 以指定的浓度（0μM，10μM-6μM，10μM-7μM，10μg-8μM）将20μL各试验BL溶液和10μL-9在水中）在90×15mm培养皿中。解决方案应在使用前立即进行准备。
2. BL溶液中的浮叶片段（参见食谱）（0M，10 <-6> M，10 <-7> M，10-sup -8和10 ^{-9 M）在29℃的黑暗中孵育2天（图3）。
  
  图3.在WT（Hwayoung品种）和OsBUL1敲除突变体（osbul1）水稻中BR诱导的椎板关节倾斜。照片是在BL（10 ^{-6 M）治疗2天后服用。}}
3. 2天后，用数码相机取样照片，用量角器打印并测量层间和鞘层之间的角度（叶片角度与叶鞘的角度）（图4）。 >
  
  图4.椎板角度测量。 A.用量角器测量椎板角度; B.在不同的BL溶液中培养48小时后，从WT（Hwayoung品种）和OsBUL1KO（osbul1）植物中分离含有叶片关节，叶片和鞘的代表性叶段浓度。 C.在0μM，10μM-8μM和10μg-6μM中与WT（TNG67栽培品种）相比，降低了OsBUL1 dsRNAi系（＃2）的叶角度， / sup> M BL解决方案（* P <0.001）。＆nbsp;

数据分析

对于每个BL浓度组（n = 6-12）使用相同数量的水稻秧苗。当ImageJ软件用于层板角度测量时，程序中打开包含米片碎片的照片文件。通过使用软件中的角度工具（ https：// imagej .nih.gov / ij / docs / tools.html ），3个点，每个椎板片，椎板片中的关节和鞘均固定，并测量三点制成的角度（图5 ）。测量角度值以Microsoft Office 2011 Excel的标准偏差表示（图4C）。 Student's t -test用于统计学意义。获得至少三次独立重复的数据。

图5.使用ImageJ程序测量层板角度使用角度工具用三个点标记绿色箭头。测得的角度由红色边框虚线标记。

笔记

BL解决方案应该做好准备。由于该测试的敏感性在所用水稻品种中不同，因此应避免与不同水稻品种的杂交数据分析。对于层板角度测量，也可以使用诸如ImageJ的图像处理计算机程序。

食谱

次氯酸钠溶液（最终有效氯为2％）为30 ml
将10ml商业漂白剂（CLOROX）加入20ml含有几滴吐温20的无菌水中，
5 N氢氧化钾（KOH）溶液30 ml
将8.417g KOH加入30ml蒸馏水中，并用注射器过滤器过滤溶液
Murashige＆amp; Skoog（MS）介质500 ml
2.2 g Murashige＆amp; Skoog基础培养基维生素
15克蔗糖
蒸馏水可达500 ml
用几滴5N KOH调节pH至5.7，并将100ml分配到含有0.3g植物凝胶的600ml烧杯中，然后用玻璃培养皿覆盖烧杯。用3M微孔带和高压釜密封烧杯
1mM油菜素甙（BL）储备液

将2mg BL（分子量480.68）溶于1ml乙醇中
加入3.16ml蒸馏水，得到1mM终浓度
然后在1 ml管中分成等分试样并储存于-20°C
串联稀释：例如，制备10μL/ L M BL溶液，将1ml BL（10-sup-3）与9ml的无菌水变成10毫升10毫升的M BL溶液

致谢

该方案改编自Jang等人描述的水稻层倾角测定方法。（2017年）。我们感谢米兰达·洛尼女士帮助英语编辑。这项工作部分得到中央研究院ABRC BCST的核心资助。

参考

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