材料和试剂

剃刀刀片（Gilette）
黑色平底座
注意：这可以是一个黑色纸张基地。
纸巾（Lucart Professional，目录号：864043）
100微米尼龙过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：NY1H00010）
幻灯片
培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1472.001）
黑颈草属性成熟植物，男性和女性
注意：海洋研究所有时可以配备允许订购和发送这种材料的设施（例如参见EMBRC-France网站， http://www.embrc-france.fr/en ）藻类可以在潮湿的组织中运输优先不超过2天的时间。

约1升天然海水
注意：或者可以制备或购买人造海水（Sigma-Aldrich，目录号：S9883）。

设备

烧杯约250毫升（费雪科学）
台灯
冰箱或冷藏室
光学显微镜配备20x和/或40x目标（Olympus）
13°C的恒温室（Pol-Eko Aparatura）
白光，理想的是90μmol/ m 2，上一次（马自达）
气密黑室（可选）

程序

配子和受精的分离
1. 在岸上收集 fucus serratus 的雌性和雄性植物（图1，步骤A1）。
  在一年的某一时期（欧洲海岸的冬季），Fucale物种的thallus尖端肿胀成容纳有丰富概念的容器。在岸上，由于精子色素中存在类胡萝卜素，所以雄性植物可以被它们的概念的橙色所识别。雌性植物是棕绿色的（图1B1和1B2）。排列女性和男性植物。为了做到这一点，手工绘制一个概念，用一滴海水将显微镜载玻片上的部分放置，并通过光学显微镜检查。显示了女性和男性概念的典型照片（图1B3和1B4）。在两个不同的批次中分离所有性成熟的叶状体（，即男性/女性）。
2. 在海水中洗涤以除去附生植物和剩余的沙子，并用自来水短暂洗涤（图1，步骤A2）。
3. 将所有片材放在纸巾上（图1，步骤A3）制作层，并将其全部卷成寿司（图1B5和1B6）。在黑暗中在4°C储存至少一周。
4. 要释放雌配子，展开纸巾，并将成熟叶子转移到含海水的烧杯中（图1，步骤A4）。在室温下在白昼或人造光照下孵育1小时。 oogonium，其中包含在F中的八个单独的卵。 serratus 将首先释放，迅速破裂以排卵。通过光学显微镜检查。
  注意：由突然的光和渗透变化引起的应力（即将样品从黑暗切换到日光并在海水中回流）有利于配子释放。
  
  图1.分离“fucus”配子和合作伙伴培育的关键阶段概述。 A.关键阶段列在左侧。 B.代表性图片显示在右侧：B1和B2。女性和男性镰刀菌属植物; B3和B4。它们各自配子的概念的横截面; B5和B6。成熟叶片的调理保存; B7。在受精48小时后获得典型的4细胞受精卵。
5. 在这个阶段，鸡蛋将在烧杯的底部快速沉降。孵育2小时后，用移液管轻轻取出一些海水，以浓缩蛋。使用100μm尼龙网过滤器过滤剩余的含有鸡蛋的溶液，以去除聚集体。将一个或两个小块的雄性叶子与新释放的鸡蛋接触（图1，步骤A5）。男性配子表现出负向光性，因此将烧杯置于充分的日光下或在人造光下放置在黑色的平底上，将有利于精子向卵移动。女性细胞释放一种性信息素来吸引精子。施肥将在精子混合15分钟内发生。 30分钟后，检查雄配子的释放和活力
  
  Video 1. Fertilisation of a Fucus serratus egg by sperm of the same species. The male gametes are motile and clearly visible as small cells actively swimming in the vicinity of the immotile female egg. Flagella on the male gametes can be detected. The egg is approximately 80 µm large.
6. 一小时后，用移液管轻轻取出一些海水并加入新鲜的海水，洗两次。使用100μm尼龙网过滤器过滤剩余的溶液。通过将烧杯放置在13℃，光照时间为12小时光照（90μmol/ m 2）以上12小时黑暗（允许）图1，步骤A6）。受精卵通过分泌细胞壁粘合剂材料自然会粘附到底层。
  注意：为了方便将来的检查，合子可以直接在显微镜载玻片上进行培养。为了做到这一点，将合子集中到适当的密度，并将250μl的溶液放在载玻片上。使用聚赖氨酸涂层的显微镜载玻片将允许合子和早期胚胎保持牢固连接。
监测
fucus serratus 合约和早期胚胎的开发
1. 典型的生长条件为13℃，光照时间为12小时光（90μmol/平方米），12小时黑暗。早期发育的不同阶段可以通过光学显微镜容易地观察到。第一个细胞分裂发生在受精后约24小时，并将胚胎分成具有不同形状和命运的两种细胞类型（图2）。
  
  图2. fucus serratus 合子和胚胎的早期发展。 A. Fucus 鸡蛋是球形的，没有明显的不对称性。 B.极化首先在形态上表现出来，受精后约20小时，当合子伸长并在一个半球上产生隆起时，即根茎。当第一次细胞分裂发生时，受精后约24小时，将受精卵横向分成两个具有不同发育命运的不对称细胞：顶端thallus细胞和根际细胞。 D.在以下细胞分裂期间，根尖细胞由顶端生长延伸，而Thallus细胞通过扩散生长扩张。
2. 定期更换周围海水，更新营养，防止干燥。培养皿培养将需要每周更换一次海水（15-50毫升）。
3. 可以通过施加光矢量来控制极轴形成和固定的取向。要做到这一点，应该使用单边光（L1）（可以使用经典的灯泡，不应位于培养皿上方，而应平行于台架）。根状细胞将沿着光矢量L1的相反方向发展（图3A）。在正常条件下，偏振轴在显影的第一个10小时期间是不稳定的，因此可以使用第二单向光梯度（L2）重定向，朝向第一个（图3B和3C）180°。该属性允许通过用药理学剂处理来控制极化的机理。使用装有单面灯泡的密封黑色室，减少了可能的外部和均匀光线的影响。
4. 胚胎可以在实验室中容易地生长一周。在这个阶段之后，成熟的胚胎在实验室培养条件下难以维持（最多4周）。与其他型号的棕色藻类不同，如Ectocarpus 丝状藻类，F的生命周期。 serratus 不能在实验室中复制。
  
  图3.极轴形成和固定方向的控制。 A.刚刚施肥（AF）后，合子在单向光照（L1）下栽培。 Rhizoid细胞将沿L1的相反方向发育。在第一个小时AF期间，接受合作的单方向（L1）种植。在轴固定（约8小时AF）之前，施加第二单向光矢量（L2），从L1定向180°。 Rhizoid细胞沿L2的相反方向发育。 C.如果在轴固定之后施加光线方向的切换，则根尖细胞将沿与第一光源相反的方向发展。

数据分析

合肥同步发展，上述协议允许同时观察数百人。对于数据分析（即，，药理学研究的形态学结果），我们建议执行三个单独的生物重复。对于每个重复，应至少观察30-100个合子。应该采用统计学测试，例如，Student's tests（Hervé等人，2016）。

致谢

最近在Hervé等人，2016中简要介绍了该协议，主要是基于以前描述的方法（Kropf等人，1988; Bouget et al。，1998）。我们承认布列塔尼地区的资助（拨款ARED_8979 ECTOPAR）。

参考

Bisgrove，S。和Kropf，DL（2008）。不对称细胞分割：岩藻类藻类的合作伙伴作为模型系统。在：Verma，D.and Hong，Z.（Eds。）。植物细胞分裂控制。 Springer pp：323-341。

Bouget，FY，Berger，F.and Brownlee，C。（1998）。＆nbsp; 位置依赖的控制细胞命运在 Fucus 胚胎中：细胞间通讯的作用发展 125（11）：1999-2008。 br />

Brownlee，C.和Berger，F.（1995）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7482785”target =“_ blank” >植物胚胎中的细胞外基质和模式：寻找发育信息。趋势Genet 11（9）：344-348。

Hervé，C.，Siméon，A.，Jam，M.，Cassin，A.，Johnson，KL，Salmeán，AA，Willats，WG，Doblin，MS，Bacic，A.and Kloareg，B.（2016） ; 阿拉伯半乳聚糖蛋白质在真核生物中有深刻的基础：鉴定基因和表位在棕色藻类中，它们在胚胎发育中的作用。新的Phytol 209（4）：1428-1441。

Kropf，DL，Kloareg，B.and Quatrano，RS（1988）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3336780”target = “_blank”>需要细胞壁来固定胚胎轴在合子中。科学 239（4836）：187-190。