材料和试剂

培养和病毒包装所需的材料
1. 直径10厘米的培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：353003）
2. 0.45微米尺寸的过滤器（Corning，/）真空过滤系统500毫升）（康宁，目录号：430512）
3. 38毫升开口管（Beckman Coulter，目录号：344058）
4. 50ml螺旋盖管（Corning，Falcon ®，目录号：352098）
5. 15毫升螺旋锥形管（Corning，Falcon ®，目录号：352196）
6. 圆底5毫升管（Beckman Coulter，目录号：344057）
7. 石蜡膜
8. 矢量系统
9. 低通293T HEK细胞（P6-P14）
10. Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11960044）
11. 胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11550）
12. L-谷氨酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
13. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
14. 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360070）
15. 胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）
16. 转染剂：Polyjet（SignaGen Laboratories，目录号：SL100688）
17. HBSS中的20％蔗糖（Hank's Balanced Salt Solution）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14025134）
18. 293T细胞（D10培养基）的完整培养基（参见食谱）
逆转录病毒滴定所需的材料
1. 24孔板
2. 分离的MEF细胞（10 细胞/孔）
3. CAG-Rosa-tdTomato记者小鼠（The JACKSON LABORATORY，目录号：007909）
4. 集中病毒
5. 将聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7890），在无菌组织培养级水中制备的0.05mg / ml，过滤灭菌的
6. 无菌组织培养级水（Sigma-Aldrich，目录号：W3500）
7. Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11960044）
8. 胎牛血清（FBS）（Atlas Biologicals，目录号：S11550）
9. L-谷氨酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
10. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
11. 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360070）
12. 用于MEF细胞（D10培养基）的完整培养基（参见食谱）
颅内立体定位注射所需材料
1. 1 cc注射器（BD，目录号：309659）和30 G针（BD，目录号：305128）
2. 高压灭菌棉提示
3. 动物
  （JACKSON LABORATORY，目录号：006440）
  （JACKSON LABORATORY，目录号：008462）
  注意：
  1. 将这些小鼠斑点与在ROSA26基因座插入的萤火虫荧光素酶基因（Durkin等人，2013）的报道系Rosa-tmLuciferase（THE JACKSON LABORATORY，目录号：005125）杂交。该生物发光记者将有助于跟踪肿瘤生长并评估候选治疗方案。将小鼠保持在混合的C57B1 / 6; 129SV; CD-1背景。
  2. 在动物工作之前，从机构动物护理和使用委员会（IACUC）获得适当的动物使用协议。
4. 聚凝胺（1μg/ ml）（Sigma-Aldrich，目录号：107689）
5. 用于吸入麻醉的异氟烷（Piramal ）（2-3％用于诱导）或腹膜内途径：氯胺酮（Ketaset ，NDC 0856-2013-01）+甲苯噻嗪圣诞老人克鲁兹生物技术公司，目录号：sc-362950Rx）组合
6. 丁丙诺啡（Buprenex 0.3 mg / ml）：稀释1 ml Buprenex + 9.0 ml D5W，用于小鼠
7. 无菌磷酸盐缓冲盐水
8. 70％乙醇
9. 氯己定（BactoShield CHG 2％手术洗刷）（STERIS，目录号：132224）
10. 异丙醇（优先保养，异丙醇70％）（FIRST PRIORITY，目录号：MS070PC）
11. GLUture ®局部组织粘合剂（Abbott，目录号：32046-04-01）
12. 人造泪液润滑剂眼科软膏（Henry Schein，目录号：18581）
13. 氯胺酮和赛拉嗪组合（见食谱）

设备

超离心浓缩所需的设备
1. 移液器
2. 无菌工作罩
3. 超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima XPN-90或同等级）
4. 振动器
5. 转子：
滴定逆转录病毒所需的设备
1. 生物安全罩
2. Neubauer细胞计数室
手术所需的设备
1. 立体定位装置（RWD Life Science，目录号：68502，带有鼠标适配器：RWD Life Science，目录号：68010）
2. 微钻（RWD Life Science，目录号：78001），用适当的钻头在头骨上制作一个钻孔（RWD Life Science，目录号：78002）
3. 高压灭菌手术包由剪刀，镊子，棉签和尖端组成，敷贴器，手术刀刀片架
4. 10μlHamilton注射器（Hamilton，目录号：7659-01），带有30G平头针（Hamilton，目录号：7803-07）
5. 孵化器或加热垫
6. 计时器
7. 生物泡或无菌工作地点
8. 手术部位标记（MEDTRONIC，Devon TM ，目录号：31145793）
9. 麻醉机（Ohmeda，型号：Excel 210SE或同等学历）

程序

图1.整个程序的示意图。 A.病毒包装和浓缩; B.立体定位颅内注射病毒以诱导胶质瘤。

转染和病毒包装程序（图1A）
注意：我们遵循制造商提供的Polyjet介导转染方案（
http://signagen.com/DataSheet/SL100688.pdf ）。
1. 第1天：电镀293T细胞
  在具有10％FBS培养基（D10培养基）的DMEM中的聚-L-赖氨酸包被的10cm直径的培养皿中的板293T细胞（约3-4×10 6）。细胞在24小时后将达到70-80％汇合。
  注意：相应地计划允许第二天5-6小时进行转染和中等变化。
2. 第2天：转染日
  1. 预转染检查
    1. 检查第二天的汇合，并使用70-80％细胞汇合的板。
      注意：更高的汇合可能是一个障碍，因为细胞没有生长空间。
    2. 转染前1 h，用新鲜的D10培养基更换培养基，每片4ml
    3. 使用下表进行10cm平板转染（表1）
      表1.转染组合
  2. 转染
3. 第3天：第1集
  1. 收集介质并以600 x g（2000 rpm）离心10分钟，收集上清液，留下细胞碎片在底部。在超速离心浓缩之前，收集的培养基可以在4℃下储存最多3天（Tiscornia等人，2006）。
  2. 加入新鲜的D10培养基，每个板10毫升，再孵育24小时。
4. 第4天：第2集
  1. 收集介质并以600 x g（2000 rpm）离心10分钟，收集上清液，留下细胞碎片在底部。
  2. 从第3天和第4天装载介质，并使用0.45μm孔径的过滤器进行过滤
5. 超速离心用于病毒浓度
  1. 我们使用Beckman Coulter转子SW 32 Ti，它具有容纳6个38毫升开口管的能力。将管平衡至0.5g的最大差异，并在6℃下以68,300×g（20,000rpm）离心2小时。每个管保持30毫升，总共360毫升的介质可以一次离心。如果需要运行更多的培养基，第一次旋转后丢弃上清液，而不会干扰沉淀物添加新鲜培养基进行第二次运行。
    注意：不要使用充满不到其容量的一半的管道，这会增加崩溃的风险。
  2. 运行后倒出上清液，从墙壁吸出剩余的液滴，不会干扰沉淀物。
  3. 将离心管转移到50ml螺旋封口的管中，并将其在4℃的振荡器上直立放置过夜，并使剩余的介质重新悬浮沉淀（大约在20-30μl/管）。
  4. 短暂离心并收集所有管中的再悬浮颗粒，将浓缩物等分至4-10μl体积，并在-80℃下储存多个月。避免重复的解冻和冻结循环，可以大大降低病毒滴度
  5. 对于体内注射，推荐通过蔗糖垫进一步纯化病毒（Tiscornia等人，2006）。
6. 蔗糖垫

滴定逆转录病毒
用于逆转录病毒滴定的CAG-Rosa-tdTomato报告小鼠（The JACKSON LABORATORY）（Durkin等，2013）的E13.5-14.5胚胎分离MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞。当暴露于Cre表达病毒时，这些细胞表达tdTomato，并允许我们评估病毒感染性。对于病毒滴定，我们使用Tiscornia等人描述的程序（2006）。

每孔用500μl聚-L-赖氨酸覆盖24孔板，37℃温育30分钟，吸出培养基，用高压灭菌去离子水洗涤，并在生物安全罩中干燥1-2小时。 />
在50孔平板中，每孔500μlD10培养基中的平板10μL/孔。最少使用8口井，其中1口为阴性对照
孵育6小时，然后6小时后检查，如果它们粘在板上。
在PBS中将10倍稀释的逆转录病毒（未稀释至10×6）稀释至总体积约50μl。
用聚凝胺改变480μlD10培养基，浓度为4μg/ ml
将20μl每种病毒稀释液加入孔中，轻轻充分混匀。
在37℃孵育细胞48小时。 TdTomato将在24-48小时内看到。
通过计数Neubauer细胞计数室或使用FACS评估tdTomato阳性细胞的百分比，并使用以下公式计算滴度：

病毒滴度≥10 / ml适合肿瘤形成。

颅内立体定位注射程序（图1B）
注意：新生儿或年轻成年小鼠也可以使用适当的立体定位装置适配器。

手术前准备
1. 打开孵化器或加热垫。
2. 检查微钻，麻醉机的氧气压力和足够的异氟醚流量和头顶光源
3. 按照制造商的说明设置立体定位仪器。
4. 打开麻醉机附带鼠标外壳。设定氧气流量（0.8-1.5L / min）和异氟烷（2-3％），用于诱导麻醉，维持时减少至1-1.5％。或者使用注射腹膜内的氯胺酮和赛拉嗪组合。
5. 将浓缩的病毒装入注射器（例如，，每个要注射的小鼠3μl）缓慢避免气泡并将其置于立体定位装置的支架上。
6. 在暴露的角膜上涂抹人造泪液以避免干燥。
外科手术

麻醉老鼠，并通过脚趾捏捏检查麻醉水平。
在立体定位装置上，用鼻子和耳柄牢固地设置小鼠，以避免在手术过程中头部的任何附件移动，并用无菌悬垂或盖子隔离外科手术区域。
使用高压灭菌的棉尖用氯己定和异丙醇清洗手术区域（颅骨背部），每次三次。等待几分钟。
在长度约1-1.5厘米的头后面做一个切口，以暴露出阳。。
调整相对于母体的立体定位装置作为参考，然后根据大脑的年龄和面积（例如）使用坐标，用于在成年小鼠中靶向胼the体，我们使用坐标：前后+ 0.2mm，横向±0.5mm，背腹2.2mm
用手术部位标记标记目标区域。
使用微型钻头在骨头钻孔，小心避免过深。
将注射器针头深度更低到所需深度（例如，这里为2.2 + 0.6mm），等待1-2分钟，并缩回到所需的深度以形成小口袋，并缓慢注射1μl病毒浓缩液，等待1-2 min，收缩1 mm，再次注入1μl。我们通常在一只成年小鼠中注射1-3μl病毒浓度。
缓慢收缩针头，以避免浓缩液泄漏。
完全收缩后，使用组织胶粘合组织瓣。
给予丁丙诺啡注射腹膜内。（0.05-0.1 mg / kg）
将鼠标放在加热垫或培养箱上，直到变得清醒。
监测小鼠接下来2-3天，并按照方案进行镇痛药。
用70％乙醇洗涤针头，用无菌水洗涤3次

数据分析

在体内生物发光成像系统如IVIS Spectrum CT（PerkinElmer）监测的大脑中，2-3周内可以注意到初始肿瘤生长。携带肿瘤的小鼠通常在注射后存活3-6周，这取决于注射时的年龄。在出生后第2天（P2）至第4天（P4）（48-96小时）注射的新生儿小鼠倾向于存活较长时间，并且可能由于未融合的颅骨骨骼的扩张而形成较大的肿瘤。脑切片用苏木精和伊红染色，观察到的肿瘤通常是浸润性和超细胞性，具有多色细胞核，栅栏坏死灶和暗示胶质母细胞瘤的微血管增生（图2）。

图2.肿瘤切片的H＆amp; E组织学。 A.显示脑中肿瘤生长的部分（虚线外壳）; B.显示胶质母细胞瘤斑块坏死（黄色箭头）和微血管增生（蓝色箭头）的典型特征的部分。（A）中的刻度尺为1mm，（B）为50μm。

笔记

只能使用健康和低通的293T或293FT细胞进行病毒包装。
不要使用小于0.45μm的过滤器来对病毒颗粒进行剪切效应。

食谱

293T和MEF细胞（D10培养基）的完整培养基
435ml补充有50ml FBS的DMEM培养基 5 ml L-谷氨酰胺
5 ml青霉素 - 链霉素
5毫升丙酮酸钠
氯胺酮和甲噻嗪组合
1ml氯胺酮（Ketaset 100mg / ml）
0.5ml的甲苯噻嗪（Anase®20mg / ml）
8.5ml D5W（5％葡萄糖水溶液）