材料和试剂

注意：所有解决方案应使用电阻率高于18.3MΩ的无菌水和分析纯试剂。

移液器提示（Corning，目录号：4154）
6孔透明聚苯乙烯平底组织培养板（Corning，Falcon ®，目录号：351146）
Polyallomer离心管（Beckman Coulter，目录号：344060）
经过认证无核糖酶的聚丙烯微量离心管和提示
iBlot TM PVDF膜（0.2μm）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：IB401001）
剃须刀片（GEM，目录号：RB-GEM-080014）
0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SCGPU05RE）
Zymo RNA Clean＆amp;集中器（ZYMO RESEARCH，目录号：R1015）
使用氯化铯密度梯度纯化并悬浮在SAMA缓冲液中的BMV病毒体注意：可以如Vaughan等人所述获得高纯度BMV病毒粒子。（2014）。病毒粒子保持在酸性缓冲液中，因为pH影响BMV病毒粒子的肿胀，并且可以改变CP-RNA相互作用。
10x片段化试剂和终止液：200mM EDTA（pH 8.0）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM8740）
Pierce TM 蛋白A / G磁珠（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88847）
抗BMV CP抗体
注意：这是我们在用高度纯化的BMV衣壳蛋白免疫的兔子中产生的多克隆抗血清。
NuPAGE ® Novex ®4-12％Bis-Tris Gel，NuPAGE MES-SDS运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：NP0321BOX）
1x MES SDS运行缓冲区
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010023）
0.1％Ponceau-S（Sigma-Aldrich，目录号：P3504）
蛋白酶K（真菌）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：25530015）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201L）
小RNA试剂盒（Illumina，目录号：RS-200-0036）
1.8倍SPRI珠（Beckman Coulter，目录号：41105518）
SPRI选择试剂（Beckman Coulter，目录号：B23317）
氢氧化钠（NaOH）（Avantor Performance Materials，Macron，目录号：7680）
HT1缓冲液（NexSeq 500试剂盒的组分）（Illumina，目录号：FC-404-2005）
乙酸钠，Na（OAc）（EMD Millipore，目录号：106268）
四水镁酸镁，Mg（OAc）2·4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M0631）
冰醋酸（EMD Millipore，目录号：AX0073-9）
乙醇，绝对（Decon Labs，目录号：2716）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
十二烷基硫酸钠钠盐（SDS）（EMD Millipore，目录号：7910-OP）
甘油（VWR，BDH ，目录号：BDH1172）
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：BP120）
SAMA缓冲区（请参阅配方）
3 M醋酸钠（pH 5.2）（见配方）
IP绑定缓冲区（请参阅配方）
IP洗涤缓冲液（见配方）
4x Laemmli样品缓冲液（参见食谱）
PK缓冲（见配方）

设备

紫外线交联剂（UVP，型号：CL-1000，目录号：95-0174-01）
Beckman Coulter Ultima Max-XP超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TM Max-XP，目录号：393315）
DynaMag-2（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
SureLock X迷你凝胶电泳系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：El0001）
iBlot ®干式印迹系统（Thermo Fisher Scientific，型号：iBlot TM 2，目录号：IB21001）
Agilent 2200磁带站（Agilent Technologies，型号：Agilent 2200）
Miseq或NexSeq500（Illumina，型号：NexSeq TM 500）

软件

绘图程序：bowtie2 ver。 2.2.6
图形程序：JBrowse ver。 1.12.1

程序

紫外线交联
1. 将每个纯化的BMV病毒粒子的100μg/ ml的400μl加入6孔细胞培养板的3孔中。将板在冰上孵育至少5分钟。将没有盖子的板放在交联机中，并以254nm至400mJ / cm 2（图1）照射三次。在照射之间，用轻轻敲打板搅拌样品，将样品混合并在冰上孵育3分钟，以防止样品过热。在冰上重复照射，搅动和孵育两次。
  注意：
  1. 使用Ni等人，2014中所述的使用氯化铯浓度梯度将BMV病毒粒子纯化至均匀。在Ni等人，2014中确定纯化的病毒粒子的浓度。
  2. 通过对通过方案处理的RNA片段进行测序，经验地确定提供BMV病毒体RNA最佳交联的照射剂量。同样的条件也成功地用于噬菌体MS2 RNA的交联（Rolfsson等，2016）。尽管如此，交联时间的修改很可能是经验地确定其他病毒粒子。
    
    图1.含有BMV病毒粒子的板在UV交联剂中的位置
2. 对于阴性对照，重复步骤A1，但不要照射病毒粒子。该对照反应可以与照射的病毒粒子平行处理
3. 将照射的病毒粒子溶液收集并收集到小型聚集体离心管中，并使用制备型超速离心机以150,000 x g离心30分钟。将病毒颗粒重悬于150μl100 mM Tris（pH 7.0）中。
4. 加入15μlRNA片段化试剂，混合并在70℃孵育15分钟注意：我们经验性地检查了核糖核酸酶的几种组合，并且在RNA切割中观察到更多的偏倚。锌诱导的RNA切割产生更多的RNA的随机切割，更容易使用，并且在样品加工期间容易除去。对于BMV，使用的条件将使BMV RNA片段长度为〜50-nt（图2）。在碎裂步骤期间，溶液的pH值和70℃下的温育将导致BMV病毒粒子解离和变性。孵育后，病毒粒子溶液应该变得阴天。对于其他病毒粒子，重要的是尝试不同的条件来鉴定那些可以产生相对较短的RNA片段的条件。
5. 加入15μl0.2 M EDTA（pH 8.0），混合并在冰上孵育10分钟以停止反应
  
  图2.来自UV-交联的BMV病毒粒子的RNA的时间依赖性断裂。所示图像来自含有100μgBMV病毒粒子的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，其被重悬于150μlTris缓冲液（pH： 7.0），并在70℃下加热至片状BMV RNA，凝胶图像上述时间。
免疫沉淀和RNA提取
1. 将50μlPierce Protein A / G磁珠悬浮液加入1.5 ml微量离心管中。加入1ml冰冷的IP结合缓冲液（参见食谱），混合，然后通过将管子放置在磁性管支架上来浓缩珠子。珠子应该集中在微量离心管的一侧。使用移液管去除上清液。重复清洗珠子。
2. 将珠重悬于100μl冰冷的IP结合缓冲液中，加入抗BMV CP抗体和来自步骤A5的交联的CP-RNA溶液，并将管置于在4℃设定的摇床上，以50rpm设定2小时。
3. 使用磁性管支架收集珠子并共沉淀蛋白质。去除上清液。加入1毫升冰冷的IP结合缓冲液洗涤珠子四次，每次使用Magnastrip收集珠粒并去除上清液。
4. 去除最终的洗液，加入100μl的Laemmli样品缓冲液（参见食谱）到珠上，在95℃下混合和加热2分钟，在预制的4-12％Bis-Tris凝胶上加载30μl样品，并运行凝胶在1x MES SDS运行缓冲液中在150V下保持1小时。
5. 使用湿转移装置（Bio-Rad Laboratories）将蛋白质 - RNA复合物从凝胶转移到PVDF膜。转移应在100 V 2.5 h。
  注意：将蛋白质从变性PAGE转移到PVDF膜将有助于去除非共价结合的RNA片段，并将降低背景。
6. 用无菌PBS缓冲液冲洗膜两次，用0.1％Ponceau-S染色10分钟。然后用无菌PBS冲洗膜两次以除去多余的染料。切断大部分膜的部分使用新的剃须刀片（图3），BMV CP带以上3-4毫米。将含有CP和交联RNA片段的膜片转移到1.5 ml无菌微量离心管中，用无菌PBS冲洗两次。
  注意：膜片可以储存在-80°C直到使用。
7. 加入200μl在PK缓冲液中稀释的1mg / ml蛋白酶K（参见食谱）至膜切片。在37℃下孵育1小时，偶尔混合消化CP。
  
  图3.从交联的BMV外壳蛋白切下的RNA的位置。图像是Western印迹转移后的膜。带有虚线的盒子表示用剃刀刀片消除的膜的面积。
cDNA文库构建和Illumina DNA测序
1. 将含有洗脱的RNA片段的步骤B7的溶液施用于Zymo RNA Clean＆amp;集中器柱。使用试剂盒中的35μl洗脱缓冲液洗脱RNA
2. 加入5μl10x PNK缓冲液和50 U PNK酶和5μl10 mM ATP。将混合物在37℃下孵育30分钟。
  注意：PNK在RNA中添加了5'-磷酸化物，以增加文库构建所需的寡核苷酸适配器。
3. 将RNA转移到新鲜的Zymo RNA Clean＆amp;浓缩柱，并从试剂盒中将7μl洗脱缓冲液中的RNA洗脱。在Agilent高灵敏度RNA TapeStation磁带上分析2μl洗脱液以确定RNA浓度。
4. 使用含有200ng至1μg洗脱的RNA的剩余洗脱液体积，使用Illumina Small RNA试剂盒构建cDNA文库。根据制造商的说明使用11至15个循环的DNA扩增构建文库，其循环数取决于存在的RNA的质量。
5. 使用安捷伦高灵敏度DNA TapeStation估算文库的浓度。
6. 然后使用1.8倍比例的SPRI选择珠（Beckman Coulter）清洗并浓缩池，并以22μl洗脱。
  注意：在TapeStation中，DNA片段的文库通过电泳从衔接子，引物二聚体和扩增过程中产生的其他DNA分子分离。预期具有cDNA侧翼的衔接长度的DNA被切除并洗脱。
7. 将文库（5μl，每个文库约500ng）用5μl0.2N NaOH变性5分钟，然后用985μl由Illumina提供的HT1缓冲液中和。加入5μl200mM Tris pH 7.5以补充HT1缓冲液的缓冲能力。
  注意：鉴于病毒基因组的规模很小，多个病毒库可以是Illumina测序运行的一小部分。即使1％的运行样本仍然可以导致每个图书馆数十万次读取。
8. Illumina NextSeq500运行由印第安那大学CGB工作人员使用75-high输出流动池指定为80 bp读取。

数据分析

修剪和质量过滤读取使用Trimmomatic ver。 0.33，截止分数最小为20（Bolger等人，2014）。不包括修剪后短于20个核苷酸的读数
使用具有默认映射参数值的计算机程序Bowtie2 ver 2.2.6（Langmead和Salzberg，2012）将读取映射到相应的引用序列。对于每次读取，仅使用由最小编辑距离定义的最佳对齐。
显示跨越JBrowse版本的参考序列的每个基本位置的读取次数。 1.12.1作为BigWig曲目（Skinner等人，2009）。

笔记

尽管该协议已经针对结合BMV衣壳的RNA的分析进行了优化，但是该方案可以直接适用于图形感兴趣的病毒粒子。关键在于高纯度病毒粒子和可以有效沉淀感兴趣的衣壳蛋白质的抗体。可以在专门从事基因组分析的设施中进行cDNA文库的构建，nex-gen DNA测序和数据分析。

食谱

SAMA缓冲区
50 mM Na（OAc）
8mM Mg（OAc）2，pH5.5
3 M醋酸钠（pH 5.2）
将12.3g乙酸钠溶解在30ml H 2 O 3中用冰醋酸调节pH至5.2
将H 2 O 2加入到50ml的
中用含有0.22μm过滤器的设备进行过滤在室温下存放
IP绑定缓冲区*
150 mM NaCl
25mM Tris（pH7.2）
0.05％吐温20
IP洗涤缓冲区*
500 mM NaCl
25mM Tris（pH7.2）
0.05％Tween-20

注意：为了方便起见，请将20x储存的缓冲液用无菌水稀释至1x使用。
4x Laemmli样品缓冲液
8％SDS
40％甘油
240mM Tris（pH6.8）
0.04％溴酚蓝
PK缓冲区
50mM Tris（pH7.5）
75 mM NaCl
6.3 mM EDTA
1％SDS

致谢

该协议是由NIH 1R01AI090280授予CK的工作成立的。该协议由Ni等人（2013）和Hoover等人的工作进行了改编。（2016）和未发表的E. Chuang的结果。感谢A. Kao在本协议中使用的摄影。

参考

Bolger，AM，Lohse，M.和Usadel，B。（2014）。 Trimmomatic：Illumina序列数据的灵活修剪器。生物信息学 30（15）：2114-2120。

Hoover，HS，Wang，JC，Middleton，S.，Ni，P.，Zlotnick，A.，Vaughan，RC和Kao，CC（2016）。＆nbsp; 罗马花叶病毒衣壳的磷酸化调节病毒感染的时间。 J Virol 90 （17）：7748-7760。

Langmead，B。和Salzberg，SL（2012）。与Bowtie 2快速的间隙读取对齐。 Nat方法 9（4）：357-359。

Ni，P.，Vaughan，RC，Tragesser，B.，Hoover，H. and Kao，CC（2013）。＆nbsp; 植物宿主可以影响brome花叶病毒（BMV）RNA的壳化：BMV病毒粒子出人意料地是异质性的。 426（5）：1061-1076。

Rolfsson，O.，Middleton，S.，Manfield，IW，White，SJ，Fan，B.，Vaughan，R.，Ranson，NA，Dykeman，E.，Twarock，R.，Ford，J.，Kao，CC和Stockley，PG（2016）。＆nbsp; 包装的直接证据信号介导的噬菌体MS2的组装.7Mol Biol 428（2 Pt B）：431-448。

Skinner，ME，Uzilov，AV，Stein，LD，Mungall，CJ和Holmes，IH（2009）。＆nbsp; JBrowse：下一代基因组浏览器。 Genome Res 19（9）：1630-1638。

Stockley，P.G，Ranson，NA和Twarock，R。（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/fvl。 12.84“target =”_ blank“>基因组在ssRNA病毒中的作用的新范例。未来Virol 8：531-543。

Vaughan，R.，Tragesser，B.，Ni，P.，Ma，X.，Dragnea，B. and Kao，CC（2014）。＆nbsp; 马铃薯病毒的三分体病毒粒子具有不同的物理性质，影响感染过程的时间。 88（11）：6483-6491。