材料和试剂

飞小瓶（例如，，VWR，目录号：734-2254）
飞瓶插头（例如，，Carl Roth，目录号：PK13.1）
选择的Gal4活化剂菌株（例如，来自Ulrich Thomas，Magdeburg，Germany的肌肉特异性表达）（例如，C57-Gal4 ，elav -Gal4 用于泛神经元表达[来自布卢明顿股票中心，布卢明顿，印第安纳州，美国]，用于神经胶质表达的repo-Gal4 来自ChristianKlämbt ，明斯特，德国]）
UAS-dMetRS 效应菌株[可根据Daniela C.Daterich＆amp;乌尔里希·托马斯]。如Erdmann等人（2015）所述，表达具有3×myc或EGFP标记的dMetRS L262G 的各种线可用
注意：我们传统上使用ONM。标准的玉米粉介质也已经在Niehues等人成功使用（2015）ANL标签，因此，我们预计其他媒体也可以没有任何限制。
奥托普通培养基（ONM，见食谱）

琼脂（Carl Roth，目录号：5210）
Semolina（当地食品店）
捣碎葡萄干（当地食品店）
贝克酵母（当地食品店）
甜菜sirup（当地食品店）
蜂蜜（当地食品店）
自来水
20％（w / v）尼泊金（见食谱）

甲基-4-羟基苯甲酸（Merck，目录号：106757）
丙基-4-羟基苯甲酸酯（Merck，目录号：107427）
100％乙醇（Th。Geyer，目录号：2246）

200mM ANL储备溶液（用于ANL的合成参见[Link; et al。，2007; Ngo等人，2009; Erdmann等人，，2015]）（见配方）

设备

烧杯（厨房/家庭年级）
浸入式搅拌机（厨房/家庭年级）
画笔（艺术用品）
飞行孵化器（例如，，SANYO，型号：MIR-553）
电炉（厨房/家庭年级）
锅（厨房/家庭年级）
汤匙（厨房/家庭年级）

程序

含ANL的飞行食物介质的制备（图1）
1. 解冻面包师的酵母。
2. 将粗粉和琼脂加入0.33L水中。不时搅拌直至肿胀完成。
3. 热量炖葡萄干，酵母，甜菜糖浆和蜂蜜在0.66升水中。在搅拌下不断搅拌混合物5分钟。
4. 加入粗粉 - 琼脂 - 混合物再次煮沸。不要忘记不断搅拌，因为混合物可能会在锅底炖。
5. 将ONM冷却至50°C。每15-20分钟搅拌1分钟
6. 加入尼泊金，搅拌至少1分钟，直到尼泊金均匀分布在食物中
7. 在烧杯中加入2毫升ANL储备溶液至100毫升ONM，最终浓度为4 mM ANL。使用浸入式搅拌机混合1分钟
8. 将等份含ANL的ONM（2-4ml）置于飞小瓶中，并在室温下完全冷却
9. 插上小瓶。
10. 含ANL的ONM可以在4℃下储存约两周。一旦ONM从小瓶壁上拆下，就丢弃小瓶。
  
  图1.含ANL的飞行食品介质的制备。：一种。显示ONM的成分：R（捣碎葡萄干）; S（粗面粉）; BS（甜菜糖浆）; H（蜂蜜）。 B.将浸泡剂和琼脂 - 琼脂加入水中并使其膨胀。将葡萄干和贝克酵母（Y），甜菜糖浆（BS）和蜂蜜（H））加入水中煮沸5分钟。 D.然后再加入SAA混合物并再次煮沸。不时搅拌冷却至50℃后，加入尼古丁和ANL并彻底混合。 E和F.然后将介质等分，并在4℃下储存之前完全冷却。
在果蝇幼虫和苍蝇中的dMetRS L262G 变体的细胞类型特异性表达
1. 收集相应活化剂菌株的原始雌性蝇。
  注意：苍蝇的数量以及后代的数量取决于您的实验设计，包括分析类型（例如MS / MS）以及Gal4激活剂在使用中的细胞选择性的有效性和程度。
2. UAS-dMetRS L262G 效应菌株（Erdmann等人，2015）的雄性蝇的活化剂菌株的原生女性苍蝇。
  注意：十字架也可以相互设置，也就是说，您可以使用UAS-dMetRS的处女女苍蝇 L262G - 将其与您的激活菌株的雄性相交叉。
用ANL实例的蛋白质的细胞类型特异性标记
1. 幼虫体壁肌肉长期标记蛋白质：
  1. 在含ANL的ONM上提高适当的杂交，使ANL在子代的所有发育阶段都存在。
  2. 在25℃升高大约5天后，保持在18°C的大约10-12天后，可以达到中期至晚期3小时阶段。
  3. 根据“点击化学（CuAAC）”和检测标记的新生合成蛋白质，进行幼体体壁的解剖。另见Bellen和Budnik（2000）。
    注意：整个幼虫提取物的生物化学方法证明很难再次执行，可能是由于溶解活动。因此，我们建议从所有其他组织分离体壁（主要包括肌肉，上皮，角质层，气管和感觉神经元）。
2. 在CNS，复眼和/或天线中表达在飞头中的蛋白质的长期标记（例如，如果dMetRS L262G ）：
  1. 在含ANL的ONM上提高杂交，使ANL在后代的发育中存在。
  2. 在子孙后代，清除父母的苍蝇。
  3. 根据“Click Chemistry（CuAAC）”和检测标记的“no novo”合成蛋白质，从成人后代准备飞头。
3. 蛋白质在幼体体壁肌肉或大脑中的短期标记：
  1. 在25°C下将ANL-ON ONM上的十字架提升1-2天。
  2. 将父母转入新鲜ANL-ON ONM 4-6小时。清除父母的苍蝇。
  3. 在25°C保持小瓶72±2小时。
  4. 用温水自来水冲洗早餐3小时，将其冲洗干净。
  5. 使用油漆刷将3日龄幼体转移到含有ANL的ONM上。
  6. 将幼虫在25°C保存24 h
  7. 根据“Click Chemistry（CuAAC）”和检测标记的“no novo”合成蛋白质，准备幼虫体壁或幼虫大脑。
4. 飞头蛋白质短期标记：

数据分析

如Erdmann等人（2015）所述，在执行铜催化的叠氮炔环加成（CuAAC，“点击化学”）后，可以分析飞行或幼虫蛋白质中的ANL以及随附的生物方案。可以通过评估如Erdmann等人（2015）中描述的运动行为和/或孵化率来分析ANL并入后的一般飞行和幼虫存活率。

笔记

重复性和变异性：当异种动物数量在小瓶中升高时，ANL的摄取和随后的标记效率可能会变化，因为根据幼虫的数量，食物将被不同的捣碎。另外值得注意的是，与成年苍蝇相比，幼虫通常会显示更强的ANL结合
含ANL的ONM在制备后的两周内最好使用，以产生可重复的结果。

食谱

20％（w / v）尼泊金
150克甲基-4-羟基苯甲酸酯 50克丙基-4-羟基苯甲酸酯溶解在100％（abs）乙醇中
奥托普通媒介（ONM）
8.3克Agar-Agar
50克粗粉+
40克捣碎葡萄干
2个酵母块（每个42克）
1汤匙甜菜糖浆
1汤匙蜂蜜
6.6 ml 20％（w / v）尼泊金
200毫升ANL储备溶液
34.4mg / 1ml ddH 2 O