第一部分：唾液腺子孢子的分离

材料和试剂

15 ml锥形离心管
两个10 ml培养皿
两个27 G针
两个1毫升注射器
玻璃幻灯片
1.5 ml塑料反应管
一次性聚丙烯杵（SP Scienceware - Bel-Art产品 - H-B仪器，目录号：F19923-0001）
蚊子
冰
RPMI（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11835063）
70％乙醇
1x PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：18912014）
牛血清白蛋白（BSA）（Carl Roth，目录号：8076）
BSA / RPMI 3％（参见食谱）

设备

真空泵
泡沫塑料盒
镊子
具有一次性提示的微型移液器
双目显微镜（ZEISS，型号：Stemi 305或任何其他制造商例如，Nikon，Olympus，Leica的可比双目显微镜）
具有相差40倍物镜的光学显微镜（ZEISS，型号：Axio Lab.A1或任何其他制造商的类似装置，例如，尼康，奥林巴斯，徕卡）
血细胞计数器

程序

用真空泵将吸入的蚊子吸入15 ml锥形离心管中，并将其放在冰上5分钟，以使蚊子平静。
准备一个具有50-100μlRPMI的反应管，用于收集唾液腺。放在冰上。
填充一个10 ml培养皿与70％乙醇和第二培养皿与1x PBS。
将27 G针连接到注射器。
将冷却的固定的蚊子转移到装有70％乙醇的培养皿中长达1分钟。这将一方面减少细菌污染，另一方面降低它们的疏水性。之后，用镊子将蚊子用1x PBS转移到培养皿中
为了分离唾液腺，在双眼显微镜下的玻璃载玻片上放置一滴1x PBS的雌性蚊子。用一针（针1）的帮助轻轻地固定蚊子的胸部，而另一根针（针2）放置在头部和胸部的交点处（图1）。

图1.放置针头及其运动的女性蚊子方案

慢慢地，但坚定地把头从蚊子的身体分开。理想情况下，唾液腺应保持与头部的连接，并可以通过其光泽的外观与其他组织轻易区分（图2）。

图2.女性唾液腺按蚊蚊子。左侧的腺体仍然附着在头部（左下方是较大的黑色物体）。比例尺=50μm。

固定头部，切断唾液腺，并将它们放入准备好的1.5毫升反应管中。继续使用剩余的蚊子，并在同一反应管中收集所有分离的唾液腺。
使用一次性聚丙烯杵来破坏反应管中的组织，从而释放子孢子。轻轻研磨约2分钟，直到溶液均匀。
为了确定子孢子的总数，在RPMI中制成20μl的1:10稀释液。或者，使用补充有3％BSA的RPMI建立活化子孢子的1:10稀释。（见注1）
将10μl稀释液转移到血细胞计数器中，并允许子孢子在室温下沉降10分钟。将剩余的子孢子储存在冰上。
使用具有相差40倍物镜的光学显微镜计数四个大计数平方的子孢子数（图3）。

图3.具有示意性子孢子的Neubauer血细胞计数器，标有红色的四个大方块，计数
使用以下等式计算子孢子总数：

总数 =（[N / 4]×10 [稀释因子]×10 [室因子]）x子孢子溶液（μl）
此外，每个唾液腺的子孢子数可以通过将N <总计除以女性蚊子的数量来确定。

第二部分：运动测定

材料和试剂

15 ml锥形离心管
1.5ml反应管
96孔或384孔光学平底板（NuncMicroWell96孔板[Thermo Fisher Scientific，Thermo ScientificSupest TM，目录号编号：267342]; Nunc TM 384孔板[Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：240074]）
乳胶灯泡
在冰上在反应管（见第一部分）中分离疟原虫子孢子
不完整的RPMI（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11835063）
Accudenz（Accurate Chemical＆amp; Scientific，目录号：AN7050 / BLK）在蒸馏去离子水中的17％w / v溶液
牛血清白蛋白（Carl Roth，目录号：8076）
BSA / RPMI 6％（见配方）
蒸馏去离子水中的17％Accudenz（见食谱）

设备

微型移液器和一次性提示
玻璃巴斯德吸管
台式微量离心机（Eppendorf）
Heraeus Multifuge 1 SR（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Multifuge 1 SR）或类似的离心机
蔡司Axiovert 200M（ZEISS，型号：Axiovert 200M）倒置显微镜或任何其他制造商例如Nikon，Leica，Olympus的等效装置; 25x（NA 0.8）或10x（NA 0.25）目标

软件

1.斐济（从 http://imagej.net/Fiji 下载）

程序

注意：如果使用5个或更少感染良好的雌性蚊子的子孢子滑翔测定可以直接进行。当使用来自5个以上唾液腺的子孢子时，由于杂质含有蚊子屑，需要对子孢子进行预处理（Kennedy等，2012）。

Accudenz净化
1. 用RPMI将未稀释的子孢子溶液的体积调节至1ml。
2. 将子孢子溶液装入3ml Accudenz垫中的15ml锥形离心管中
3. 在2,500 x g的情况下，在室温下不用刹车旋转管20分钟
4. 用玻璃巴斯德吸管收集包含纯化的子孢子的界面，并将溶液转移到干净的1.5ml反应管中（参见Kennedy等人，2012年的图1A）。
5. 在桌面微量离心机中，室温下以17,000 x g（最高速度）旋转3分钟。
6. 弃去上清液，将沉淀的子孢子重悬于50μl不完全RPMI中
7. 按照第I部分步骤8-11中所述计算子孢子。
运动测定
1. 在RPMI中制备6％牛血清白蛋白溶液（见注1）
2. 确定适当体积的子孢子溶液并将其转移到干净的1.5ml反应管中。在384孔板中使用96孔和500个子孢子在25μl中每50μl总共约2,500个子孢子便于运动测定。使用不完全RPMI调整体积，但考虑要测试的药物，激活剂或抑制剂的体积。
3. 如果适当，加入待测浓度的药物，活化剂或抑制剂（见注2）
4. 通过在RPMI中分别加入50μl或25μl6％BSA（96孔或384孔板）（最终浓度为3％BSA）来激活子孢子，并将溶液转移到优选的孔中板。
5. 在室温下在离心机中以200×g旋转96孔或384孔板3分钟。
6. 将板转移到Axiovert 200M显微镜，并使用25孔目标的96孔板（视频1）和3×3目的用于384孔板，每3秒开始记录1次图像。从3个独立实验中记录至少3部电影，以获得适当数量的子孢子进行分析。请注意，绝对有必要在不同实验之间保持相同的设置，否则不能比较结果。
  
  Video 1. Representative video of gliding sporozoites on glass recorded with a frame rate of 1 image every 1.5 sec for a time frame of 90 sec. Scale bar = 10 µm.

数据分析

通过使用斐济的手动跟踪插件（Carey等人，2013）可以通过人工跟踪来进行个体子孢子速度的分析。或者，可以确定在100秒内实现滑翔子孢子的圆数，并将其用作速度的代理（Hegge等人，2010）。
对于子孢子运动模式分类，可以使用斐济（Image-＆gt; Stacks-＆gt; z-Project-＆gt; Max intensity-＆gt; OK）来执行各个动画的z投影，然后手动地将模式分配给附着的挥动或滑翔（图4）。

图4.运动测定。：一种。电影和B. z投影的第一张幻灯片; C.连续滑行（红色方块），D.挥动（蓝色方块）和E.补片滑翔（橙色方块）的例子。最大投影=最大投影。
为了进行深入分析，必须手动对电影进行全面调查，以确定其他形式的运动，或子孢子是顺时针还是逆时针滑行。
使用10x目标记录的荧光子孢子的电影也可以使用也存在于斐济的自动跟踪插件ToAST（Hegge等人，2009）进行分析。每个子孢子的输出数据记录速度，平均速度以及所有追踪子孢子的详细运动模式。

笔记

在开始实验之前，始终准备新鲜的3％或6％BSA / RPMI溶液。
当测试不同的化合物或浓度时，在显微镜下计划至少10-15分钟以评估每个反应混合物的滑翔。为了确保相同的孵育时间，可以延迟添加化合物和/或BSA，直到完成先前样品的测量。
一般来说，来自啮齿动物的子孢子感染疟疾模型物种如P. berghei 或 P。 yoelii 显示出强大的运动性，并且大多被调查以了解潜在的分子机制。在细胞质中表达荧光蛋白的子孢子是最容易处理的。然而，也可以分析来自人感染物种的非荧光子孢子。
清除唾液腺是很重要的，因为像蚊子杂质这样的杂质会影响滑翔和复杂的图像分析。

食谱

BSA / RPMI 3％
称量0.03毫克BSA，理想情况下直接在反应管中加入1ml RPMI
涡旋直至白蛋白晶体完全溶解实验期间存放在冰上
BSA / RPMI 6％
称量0.06毫克BSA，理想情况下直接在反应管中加入1ml RPMI
涡旋直至白蛋白晶体完全溶解实验期间存放在冰上
蒸馏去离子水中的17％Accudenz
称量1.7毫克Accudenz在一个15毫升锥形离心管
加入10ml蒸馏去离子水旋转直至粉末完全溶解该溶液可以在4°C下储存至少一周

致谢

资助：德意志联邦研究中心的SFB 1129合作研究中心。

参考

Carey，AF，Menard，R.and Bargieri，DY（2013）。＆nbsp; 计数子孢子运动。方法Mol Biol 923：371-383。

Hegge，S.，Kudryashev，M.，Smith，A.和Frischknecht，F。（2009）。疟原虫子孢子运动模式的自动分类显示在唾液腺感染期间向生产性运动转变。生物技术J 4 （6）：903-913。

Hegge，S.，Munter，S.，Steinbuchel，M.，Heiss，K.，Engel，U.，Matuschewski，K.and Frischknecht，F。（2010）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20159960”target =“_ blank”>疟原虫子孢子之间的多步粘附。FASEB J 24（7）：2222-2234。

Kennedy，M.，Fishbaugher，ME，Vaughan，AM，Patrapuvich，R.，Boonhok，R.，Yimamnuaychok，N.，Rezakhani，N.，Metzger，P.，Ponpuak，M.，Sattabongkot，J.，Kappe， SH，Hume，JC和Lindner，SE（2012）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23244590”target =“_ blank” >用于疟原虫子孢子的快速且可扩展的密度梯度纯化方法。疟疾J 11：421.