材料和试剂

移液器提示（Thermo Fisher Scientific，Finntip TM 移液器提示）
19.5针规（BD，目录号：305187）
针（BD PrecisionGlide TM 针）
硝酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88018）
BIOMAXTM BML电影（Carestream Health，目录号：876-1520）
显微镜载玻片（MenzelGläser，SuperFrost Plus）（VWR，目录号：631-9483）
封面（Fisher Scientific，目录号：12-546-2）
组织盒，成型盖（ProSciTech，目录号：RCH40-W）
活检垫，100％网状泡沫（Trajan Scientific and Medical，目录号：BPBL）
聚苯乙烯立方体
10厘米培养皿（康宁，目录号：430591）
转移移液管，聚乙烯（Sigma-Aldrich，目录号：Z350826-500EA）
电池刮刀（VWR，目录号：734-0386）
D-Tube TM 透析器（Merck，UK）
C57BL / 6小鼠（澳大利亚西澳大利亚动物资源中心）
100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：443611）
非无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010031）
尿素（VWR，BDH ®，目录号：BDH4602）
氯化胍（GuCl）（Sigma-Aldrich，目录号：G3272）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
二硫苏糖醇（DTT）（Melford实验室，目录号：MB1015）
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I6125）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
Tris碱（Roche Diagnostics，目录号：10708976001）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1416）
周期酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7875）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9967）
焦亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：31448）
席夫试剂（Sigma-Aldrich，目录号：3952016）
N，N，N-二甲基 - 苯二胺（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：D5004）
N，N，N-二甲基-M-苯二胺（HCl）2（Sigma-Aldrich，目录号：219223）
氯化铁（III）（FeCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：157740）
阿尔肯蓝8GX（AB）（Sigma-Aldrich，目录号：A5268）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
脱脂奶粉（Sigma-Aldrich，目录号：1443825）
Odyssey ®阻塞缓冲区（LI-COR，目录号：P / N 927-40000）
Muc2抗体：Muc2.3，兔多克隆抗体（内部制造）或H300 Muc2，兔多克隆抗体（Santa Cruz biotechnology，目录号：sc-15334）
增强型化学发光底物，Western Lightning Plus / ECL（PerkinElmer，目录号：NEL105001EA）
IRDye ® 800CW驴抗兔IgG（H + L）（LI-COR，目录号：P / N 925-32213）
过氧化物酶AffiniPure驴抗兔IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-035-152）
碱性磷酸酶AffiniPure山羊抗兔IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：111-055-003）
苏木精（Sigma-Aldrich，目录号：H3136）
硝基蓝四唑（片剂）（Sigma-Aldrich，目录号：N5514）
蜡（MÜNZING，目录号：CERETAN WE 3501）
二甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：214736）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：484016）
Pertex安装介质（MEDITE，目录号：41-4012-00）
10％中性缓冲福尔马林（从CONFIX PURPLE稀释，10％NBF X5浓缩物稀释）（澳大利亚Biostain，目录号：ACFP）
氯胍（GuCl）还原缓冲液（参见食谱）
加载缓冲区（见配方）
TAE缓冲区（见配方）
4x SSC缓冲液（见配方）
周期酸溶液（见配方）
偏亚硫酸氢钠溶液（见配方）
高铁二胺溶液（见配方）
Alcian蓝色解决方案（见配方）
TBST缓冲区（见配方）
牛奶阻塞缓冲液（见配方）

设备

弯曲镊子
移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus）
弹簧剪（Fine Science Tools，目录号：15018-10）
镊子（世界精密仪器，目录号：501216）
15 ml Falcon锥形管转子（Beckman Coulter，型号：C1015）
孵化器
电泳凝胶槽（图1）（Plaztek Scientific，目录号：Wini-000）
电泳电源组（图1）（选择Bioproducts，型号：BioVolt 250V）
（Bio-Rad Laboratories，型号：785型）
Odyssey ® CLx Imager（LI-COR，型号：Odyssey ® CLx）
微自旋组织处理器（STP）120（Microm UK Ltd.）
Micron Cool Cut HM355S切片机（Microm，型号：HM355S）
Microtome刀片MX35（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：3052835）
水浴（Thermoline Scientific，目录号：TWB-D-SERIES）
奥林巴斯明场显微镜（奥林巴斯东京，日本）

图1.电泳凝胶槽（右）和电泳电源（左侧）用于凝胶电泳分析粘蛋白

图2.具有真空吸墨室（正面）和真空泵（背面）的真空印迹单元

软件

NIS-Elements软件v.3.0（Nikon，Tokyo，Japan）
Image Studio TM Lite软件（LI-COR Biosciences）

程序

为本协议中包含的所有程序（图3）
提供了一个大纲

图3.描述的程序的大纲

粘液和粘液的生物化学分析
1. 根据PC2实验室的宿主机构根据批准的道德准则，使用颈椎脱位使小鼠安乐死。
2. 用70％乙醇喷雾小鼠以避免毛发样品的污染。
3. 中线切口用腹部剪刀制成。
4. 使用弯曲的镊子轻轻地拉出肠。在胃和直肠末端附近切断肠，并将其切开。小肠，盲肠和结肠应分开保存以进行分析。
5. 可以进行两种不同的分析：存在于小肠中的总粘液以评估覆盖并保护肠上皮的粘液屏障或分泌的粘液的总体变化。
  1. 将肠子放在10厘米的培养皿中。用PBS轻轻冲洗肠道，以便通过一个开口端使用带有19.5针的针头的注射器去除粪便。 PBS的量将根据所使用的小鼠应变和/或部分肠而变化。通常使用最多5 ml用于结肠，7 ml用于小肠，大约3-4 ml用于盲肠。这种材料被丢弃，除非微生物群分析需要。
  2. 将肠子放入新的陪替氏培养皿中，用3M尿素（每次冲洗2ml）缓慢冲洗肠道5次，以从肠腔中获得分泌的粘液。推荐使用3M尿素，因为较高浓度的尿素或使用GuCl会导致肠上皮细胞层的破坏。分离的材料是粘稠的;因此使用塑料转移移液管将材料转移到冰上的15 ml Falcon管中。
  3. 将肠组织加工成组织学（如方法B - 粘蛋白糖蛋白的组织化学分析所述）（在肠的一小部分之间）和用尿素冲洗（整个肠）之后，确保仅分泌分泌的粘液，肠隐窝保持完好。
  1. 将肠子放在10厘米的培养皿中。用PBS轻轻冲洗肠道，以便通过一个开口端使用带19.5针规的针头的注射器去除粪便。重要的是确保肠只被轻轻地冲洗;否则分泌的粘液层将会丢失。 PBS的量将根据所使用的小鼠和/或部分肠的应变而变化。通常使用最多5 ml用于结肠，7 ml用于小肠，大约3-4 ml用于盲肠。这种材料被丢弃，因为它由不溶性粪便物质和可忽略量的分泌的粘液组成（如以前由作者研究的，通过Western印迹未检测到粪便粘蛋白物质）。
  2. 使用弹簧剪刀将肠切开纵向。一旦打开，刮掉剩余的粘液，使用细胞刮刀。这将去除存在于杯状细胞以及分泌的粘液层中的粘蛋白并代表总肠粘液。
  3. 将粘液转移到15ml Falcon管中，并使用Beckman Coulter 15ml旋转器通过旋转在4℃下溶解在6M GuCl还原缓冲液（参见食谱）中。 GuCl是一种强烈的离液剂，使蛋白质变性，推荐用于从动物中分离的总粘液的溶解。一旦溶解，将样品储存在-80°C，直到需要。
6. 通过琼脂糖凝胶电泳分离粘蛋白
  1. 现在可以使用琼脂糖凝胶电泳分析总粘液和/或分泌的粘液。
  2. 在凝胶电泳之前，在37℃下用50mM DTT将粘液样品减少2小时以分解二硫键。
  3. 还原后，向粘液样品中加入0.125M碘乙酰胺，并在室温下在黑暗中孵育30分钟，使其成为羧甲基化粘液，以防止二硫键的重组。
  4. 然后可以使用D-Tube TM透析器（3-6kDa或更低的Mw截止值）在GuCl中最多3ml分离的样品在3-6M尿素中透析。透析尿素是必不可少的，因为GuCl具有非常高的盐含量。
  5. 10％（v / v）加载缓冲液（见食谱）在电泳前加入样品
  6. 将样品在含有0.1％SDS的TAE缓冲液（参见食谱）中，在30V下在0.7-1％（w / v）琼脂糖凝胶（约5-7mm厚度）上电泳15小时（Thornton等， / em>，2000）（图1）。
  7. 电泳后，使用785 Bio-Rad真空印刷机（Sheehan and Thornton，2000），在4×SSC运行缓冲液（参见食谱）中以45-50毫巴的压力通过真空吸印将粘蛋白转移到硝酸纤维素膜上约1.5-3小时（图2）。为了确保密封，在真空吸印过程中可以使用0.7％的琼脂糖来密封凝胶的两侧。一旦整个加载染料从凝胶中消失，就停止真空吸印过程并且凝胶被处理。注意，真空吸印一贯导致有效的粘蛋白蛋白转移，是推荐的方法。使用镊子小心地去除硝酸纤维素膜，并且可以通过使用三种不同的方法进行分析（如步骤A7-A9所述）。
    
    为了确定粘蛋白糖基化的变化，可以使用下面详细描述的两种分开的方法。周期酸Schiff's-Alcian蓝染色可以区分酸性和中性粘蛋白，而高铁二胺 - 阿尔西蓝染色可用于鉴定粘蛋白硫酸化和唾液酸化的变化。
7. 使用PAS染色检测糖蛋白
  1. 本方案中使用的试剂体积取决于硝酸纤维素膜的尺寸，应足以完全覆盖膜。
  2. 用dH 2 O洗涤硝酸纤维素膜。
  3. 在室温下将硝酸纤维素膜与高碘酸溶液孵育30分钟。周期酸将氧化粘蛋白糖蛋白中的邻位二醇。
  4. 用dH 2 O 3彻底清洗膜以除去高碘酸溶液。
  5. 将硝酸纤维素膜与偏亚硫酸氢钠溶液（参见食谱）一起孵育5分钟，弃去溶液，再重复该步骤。这一步对于减少背景染色至关重要。
  6. 将Schiff试剂加入到膜中，并在室温下孵育约10-15分钟。通过高碘酸暴露的粘蛋白糖蛋白中的邻位二醇将与希夫试剂反应，产生紫红色的颜色。
  7. 用偏亚硫酸氢钠溶液冲洗膜，然后用dH 2 O 3洗涤以停止反应。
  8. 在使用Odyssey ® CLx Imager和光密度分析（Thornton等人，1994）（图4）进行扫描之前，使用空气干燥的硝酸纤维素膜。
    
    图4.用PAS和抗Muc2抗体染色的扫描的硝酸纤维素膜从4只单独的C57BL / 6小鼠中提取来自结肠的总粘液，并使用1％琼脂糖凝胶电泳分析并转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用PAS（A）或抗Muc2抗体（B，H300，来自Santa Cruz）染色，并使用红外标记的二抗展开。使用Odyssey ® CLx Imager扫描膜。
    注意：每个单独的动物结肠产生足够的粘液用于凝胶电泳分析 - 表明空泳道为阴性对照。
8. 使用高铁二胺（HID）检测硫酸化糖蛋白
  1. 本方案中使用的试剂体积取决于硝酸纤维素膜的尺寸，应足以完全覆盖膜。
  2. 用dH 2 O洗涤硝酸纤维素膜。
  3. 在室温下孵育硝酸纤维素膜与HID溶液（见食谱）18小时
  4. 在使用Odyssey CLx Imager（Hasnain等人，2017年）进行扫描之前，在dH 2 O中清洗膜并进行空气干燥。 >
9. 粘蛋白蛋白免疫检测
  1. 本方案中使用的试剂体积取决于硝酸纤维素膜的尺寸，应足以完全覆盖膜。
  2. 在TBST缓冲液中短暂洗涤硝酸纤维素膜（见食谱）。
  3. 在室温下用阻滞缓冲液（参见食谱）或奥德赛封闭缓冲液至少30分钟的膜（或者膜可以在4℃下保持封闭缓冲液过夜）。
  4. 洗涤膜2次，每次用TBST缓冲液洗涤15分钟
  5. 与抗Muc2抗体（在封闭缓冲液中稀释）一起在4℃下孵育
  6. 使用TBST缓冲液，每次洗涤5分钟，洗涤膜2次
  7. 与在封闭缓冲液中稀释的合适的二次抗体在室温下孵育30分钟
  8. 对于辣根过氧化物酶（HRP）共轭二级抗体，将过氧化物酶缀合的驴抗兔IgG与TBST在1×10,000稀释液中在室温下孵育1小时。然后使用TBST缓冲液将膜洗涤3次，每次洗涤5分钟。用增强的化学发光西方检测试剂孵育膜约2分钟，然后洗涤以除去过量的残留物，随后在黑暗中将硝酸纤维素膜暴露于BIOMAX＆lt; B＆gt; BML膜。
  9. 对于磷酸酶缀合的第二抗体，将磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG与TBST在1 / 10,000稀释液中在室温下孵育1小时。在TBST缓冲液洗涤3次后，然后将膜与硝基蓝四氮唑（NBT）/ 5-溴-4-氯吲哚-3-基磷酸盐底物孵育5分钟，开发。
  10. 对于红外荧光染料标记的抗体，IRDye800CW驴抗兔IgG在室温下用TBST在1 / 2,000稀释液中与膜温育1小时。在TBST缓冲液中洗涤3次后，硝酸纤维素膜可以使用OdysseyCLx成像仪直接在700或800nm进行扫描（图4B）。
粘蛋白糖蛋白的组织化学分析
1. “瑞士卷”技术
  1. 如步骤A1-A4（图5A）所述解剖肠。然后使用弹簧剪刀纵向切开肠（图5B），并通过使用P200移液管针头缓缓除去粪便物质（图5C）。在直肠末端从镊子的帮助下将肠围绕16号针头（图5D和5E）。然后使用30号针（图5F）将卷固定在小块聚苯乙烯上，并放置在固定溶液（4％PFA或10％中性缓冲福尔马林图5G）中24小时（Reilly和Kirsner，1965）。 />
2. 组织加工
  1. 将瑞士卷转移到嵌入盒（图5H）中并置于70％乙醇中。
  2. 使用微自旋组织处理器（STP）的过程样品120.样品然后经过一系列溶剂（1个变化为70％，90％，95％乙醇，3个100％乙醇变化，3个二甲苯变化和3个变化的石蜡）在嵌入蜡之前共8小时。
  3. 石蜡细胞块（图5I）可以在室温下储存，直到用切片刀片MX35的Micron Cool Cut HM355S切片机切割成4μm样品的厚度。
  4. 将切片在温水浴（37.4℃）中漂浮，然后放置在显微镜载玻片上，在37℃下干燥过夜，并在室温下储存直至使用。
    
    图5.小鼠肠切除术和“Swiss Roll”技术用于组织学小鼠肠被解剖（A），然后使用弹簧剪刀（B）纵向打开，并使用P200尖端（C）去除粪便。在镊子（D，E）的帮助下，肠子围绕16号针头卷绕。将瑞士卷固定在聚苯乙烯立方体上，两个针针相反方向（确保针不放置在组织中）（F），然后放入具有10％缓冲福尔马林固定的样品瓶（G）中。固定的瑞士卷被转移到用于石蜡包埋的组织学盒（H）中（I）
3. 周期酸Schiff's-Alcian Blue（PAS-AB）染色
  1. 染色前，通过二甲苯和乙醇在各溶液中梯度洗脱5分钟（2次二甲苯，2次100％乙醇变化，1次95％，70％乙醇），使载玻片再水化。将再水化的载玻片置于PBS中以进一步染色。
  2. 将载玻片在AB溶液中放置5分钟，然后在ddH 2 O中短暂洗涤。 AB染色硫酸化和唾液酸化糖蛋白。
  3. 对于中性糖蛋白的染色，在室温下将载玻片与0.1M氢氧化钾在dH 2 O中孵育30分钟。
  4. 将载玻片置于1％的高碘酸溶液（参见食谱）中5分钟，然后在ddH 2 O中彻底洗涤以除去酸性溶液。
  5. 然后将载玻片放入希夫试剂中10分钟，再次在ddH 2 O中洗涤。
  6. 将所有载玻片在运行的dH 2 O下洗涤10分钟，并用苏木精复染30秒。
  7. 将滑块在热的ddH 2 O（加热的ddH 2 O，高功率，微波30秒）下洗涤15至30秒。
  8. 将幻灯片置于乙醇梯度（70％至100％）中，并用二甲苯脱水，使用Pertex安装介质安装并用盖玻片密封（图6）。
    
    图6. C57BL / 6小鼠的小肠，近端结肠和远端结肠中PAS-AB染色的图片中性糖蛋白以品红色（红色箭头，描绘糖萼）染色，两者均为粘蛋白酸性和中性电荷以紫色（蓝色加洋红色染色，绿色箭头）染色，酸性糖蛋白以蓝色（黑色箭头）染色。这些载玻片用苏木精复染（如步骤B3f所述）。比例尺=200μm（低功率），100μm（大功率）。
4. 高铁二胺 - 阿尔辛蓝（HID-AB）染色

数据分析

粘蛋白凝胶的光密度分析

应包括2-3个生物样品用于每组的定量。
为了量化粘蛋白凝胶的带强度，使用Image Studio TM Lite软件。使用软件中的对象绘图工具在每个粘蛋白条带上绘制具有相同尺寸的多个感兴趣的区域。频带强度由软件自动计算为任意数。该数字可用于组之间的进一步比较。

组织学染色的定量

对盲样进行定量。
为了在组织学染色后定量组织切片中的阳性染色，应采取一只小鼠的多张照片（通常3-4张照片）。使用奥林巴斯明视野显微镜（40x镜头）将图像随机地放置在具有纵截面隐藏区域，以保持采样过程无偏差（尽管可以使用任何镜头拍摄照片，但必须保持采样过程一致）。重要的是确保纵向切片的隐窝被量化，因为它限制了变异，伪像和假阴性染色的可能性。
在每个图像中，NIS-Elements软件v.3.0中的RGB像素拾取工具定义了正染色。使用RGB像素拾取工具点击正面染色区域，软件可以选择对于完全相同染色呈阳性的区域。这通过定义正染色区域的实际RGB像素来实现。背景染色通常使用稍微较浅的颜色（不同像素）不会被软件拾取。对每个样本中的多个隐窝计算正面染色所占据的纵剖面隐藏区域的百分比（图8），并确定该样本的平均值，并用于统计分析。

图8.使用NIS-Elements软件定量阳性染色 A.原始图片显示深棕色的Muc2阳性染色。 B.阳性染色由NIS-Elements软件中的RGB像素拾取工具定义。例如，为了量化纵断面隐窝中的杯状细胞体积，计算每个隐窝的阳性染色百分比，其中阳性染色所覆盖的面积除以隐窝的面积。在取平均值之前，分析每个样本的三到五个个体隐窝。

食谱

氯胍（GuCl）还原缓冲液
6M GuCl溶解在具有5mM EDTA，pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中
加载缓冲区
50％（v / v）甘油在10倍TAE缓冲液中溴酚蓝
1％（w / v）SDS
TAE缓冲区
40mM Tris乙酸盐在1mM EDTA溶液中，pH8.0
4x SSC缓冲区
0.6M氯化钠和60mM柠檬酸钠在H 2 O，pH 7.0中
周期酸溶液
1％（w / v）高碘酸在3％（v / v）乙酸溶液中
偏亚硫酸氢钠溶液
0.1％（w / v）偏亚硫酸氢钠在0.01M HCl溶液中
高铁二胺溶液
120mg N，N'-二乙基间苯二胺（HCl）2
20mg N，N'-二甲基 - 苯二胺（HCl）
溶于50ml的ddH 2 O - / - 立即添加1.4ml 10％FeCl 3（新鲜每次准备）
Alcian蓝色解决方案
1克Alcian蓝8GX电源
100ml 3％冰醋酸
使用乙酸将pH调节至2.5
TBST缓冲区
150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH 8.0，含0.05％Tween-20 牛奶阻塞缓冲器
TBST缓冲液中1％（w / v）脱脂奶粉

致谢

昆士兰大学博士后研究员目前支持Sumaira Hasnain。昆士兰大学研究优秀奖基金会Sumaira Hasnain支持冉王。二胺方法最初由Spicer（Spicer，1965）描述，并已被修改用于我们的研究。 David Thornton，John Sheehan和Ingemar Carlstedt（Thornton等人，1994）最初开发了使用适于动物研究的硝酸纤维素膜上的蛋白质印迹来评估人类样品中的粘蛋白的方法。

参考

Arike，L.，Holmen-Larsson，J.and Hansson，GC（2017）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28122822 “目标=”_空白“>肠道Muc2粘蛋白O-糖基化受微生物群落的影响，并受糖基转移酶的差异表达调控。糖生物学 27（4）：318-328。
Hasnain，SZ，Dawson，PA，Lourie，R.，Hutson，P.，Tong，H.，Grencis，RK，McGuckin，MA和Thornton，DJ（2017）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28192541”target =“_ blank”>粘蛋白硫酸化的免疫驱动改变是三叉戟蠕虫驱除的重要介质。 PLoS Pathog 13（2）：e1006218。
Reilly，RW和Kirsner，JB（1965）。＆nbsp; Runt肠道疾病。实验室投资 14：102-107。
Sheehan，JK and Thornton，DJ（2000）。＆nbsp; 异质性和凝胶形成粘蛋白的大小分布。 Methods Mol Biol 125：87-96。 Spicer，S. S.（1965）。组胺化学差异粘膜状态的二胺方法。 J Histochem Cytochem 13：211-234。
Spicer，SS（1965）。用于区分粘液状态的二胺方法组织化学。 J Histochem Cytochem 13：211-234。
Thornton，DJ，Carlstedt，I. and Sheehan，JK（1994）。＆nbsp; 鉴定硝酸纤维素膜和凝胶上的糖蛋白。方法Mol Biol 32：119-128。

Thornton，DJ，Khan，N. and Sheehan，JK（2000）。＆nbsp; 分离和鉴定粘蛋白及其糖型。方法Mol Biol 125：77-85。