材料和试剂

透明柔性管（VWR，目录号：228-0708）
塑料密封胶带（Terostat VII，Teroson）（Rubans de Normandie，目录号：7TE）
生长在水培植物的根。不定根生长在部分浸在Hoagland半强度营养液中的杨木木屑上（Sigma-Aldrich，目录号：H2395）
注意：本议定书最初设计用于监测疟原虫根系的生长（Bizet等，2015）。该方案适用于任何容忍水培或体外培养的植物物种（见步骤D3）。

设备

透明有机玻璃®生长监测室（专门建造，尺寸12厘米长x 5厘米大x 6厘米高），一侧有孔用于营养液流入和流出（图1）

图1.定制透明有机玻璃 ® 增长监控室
水泵（例如，，小型水族馆泵，例如Newa，型号：NJ600，水族馆店铺）
温度控制暗室（范围21-23°C）
注意：整个系统需要大约1米的实验室工作空间。
空气泵（例如，，带有旋转开关的水族馆泵，例如JBL，型号：Prosilent a300，水族馆店铺）
石头扩散器（例如，JBL，型号：Prosilent Aeras Micro S2，水族馆商店）
小塑料储罐（缓冲罐，容积不大，尺寸12 x 20 x 40厘米 3 ）
注意：塑料桶适合。
修改后的数码相机（请参阅程序A，如何清除红外线滤镜）
注意：只要有可能进行红外线转换，并使用制造商的软件或免费软件，如Digicamcontrol（支持的相机列表： http://digicamcontrol.com/cameras ）。还应考虑光敏度和捕获尺寸以获得最佳图像质量。

红外灯（840-850nm）（珍珠，目录号：KT4243-907）

延长管（Kenko，AF 12/20/36 mm，尼康）

配有翻译台的光学轨道（Edmund Optics，目录号：59-263）

带旋钮和螺纹适配器的转向节（Edmund Optics，目录号：53-887和58-988）

宏观目标（Nikkor 60 / 2.8 D ASF）

软件

用于图像分析的软件（例如，来自Basu等人的Kineroot，，2007）
斐济（ https://fiji.sc ）
Rawtherapee（ http://rawtherapee.com ）
Digicamcontrol（ http://digicamcontrol.com ）

程序

用于红外线检测的数码相机修改
使用红外线需要能够检测高于700nm波长的经过修改的数码相机。幸运的是，用于数码相机的电荷耦合器件（CCD）传感器技术可以检测到高达1000nm的光。然而，传感器的灵敏度受到低通滤波器的限制，该滤波器阻挡了高于720-750nm的红外光，这取决于制造商。因此，为了使用数码相机进行红外成像，需要去除低通滤波器 - 其由无色玻璃滤光片（例如，Schott WG280）的替换是期望的，以防止灰尘颗粒传感器。滤波器更换广泛应用于天文摄影，而有关如何清除低通滤波器而不损坏相机CCD传感器的教程便可在互联网上获得（ https://www.lifepixel.com/tutorials/infrared-diy-tutorials ），专业公司也提供这项服务例如，上面提到的LifePixel或 http：//www.eosforastro。 COM ）。图2显示了在红外光下用修改后的相机拍摄的两种不同种类的根的实例注意：选择高品质（例如，宏观）镜头的高分辨率数码相机对于避免图像的光学像差（失真）非常重要。这对于确保整个图像框架中的器官生长跟踪是准确的至关重要。为了检查镜头像差，应该拍摄精确绘制的方格网格并检查像差度，可以对像差进行数字校正，但是选择相机光学镜件避免这些问题要好得多。网格也可用于校准从像素到距离测量的增长测量。

图2.玉米（A）和杨树（B）的红外光下根尖的实例。使用带有宏观物镜（Nikkor 60 mm）的带有滤镜的尼康D5200拍摄照片。比例尺为1 mm。来自Bizet等人的玉米图片（2015）。

注意：随后的步骤是从在水培中栽培的杨树切片获得的匍匐根。可以使用适应的生长监测室和材料来容易地附着植物，来适应来自各种物种的重力根。

近红外光照下根生长监测
1. 启动相机的间隔计。在图像间选择3分钟至30分钟的间隔，可以以不同的分辨率捕获生长。
  注意：大多数相机可以使用制造商的软件或免费软件（如Digicamcontrol）进行计算机控制（ http://digicamcontrol.com ）

图像处理
根据期望的时间分辨率，可以在运动学分析期间处理许多图像。为了优化粒子图像测速计算时间和分辨率（例如，，拟南芥的小根），应考虑图像预处理的后续步骤。这些预处理步骤可以使用允许批量处理的免费软件，如斐济（ https：// fiji .sc ）或Rawtherapee（ http://rawtherapee.com ），后者能够从各种制造商处读取原始图像格式（例如，尼康或尼康的.crw为佳能）。我们使用Rawtherapee的批处理（有关详细信息，请参阅在线帮助文件），步骤如下：
1. 通过删除未使用的信息来裁剪图像以优化计算时间。
2. 适应黑色阈值以降低背景噪声。
3. 清除曝光过度的区域。
4. 修改局部对比度以模糊未使用的像素比例细节。
5. 增强连续图片之间更稳定的像素补丁（图5A）
然后使用用于根生长运动学分析的专用软件（例如Kineroot（Basu等人，2007;图5B））打开预处理的图像。我们与绿色通道合作，展现出更大的对比度。请参阅 http://plantscience.psu.edu/研究/实验室/根/方法/计算机，了解Kineroot的详细手册。一组原始图像，一组经处理的图像和所得分析的电影提供为
补充材料。

图5.使用预处理的图像进行Kineroot软件的运动分析。：一种。与原始图片（上图）相比，图像预处理（底部）后的运动学分析的增强图像纹理图案。刻度棒表示1 mm。 B.使用Kineroot进行根监控的示例。通过粒子图像测速法沿着根中心线追踪红点。监控参数可以在不同的面板中看到。请注意，R和N参数（均设置为40像素）必须适应于空间和时间分辨率（389像素mm -1 和连续图像之间6分钟）。

增长监测系统的灵活性

根形状和变形的3D监控：将顶视图添加到初始侧视图允许重建根的3D形状。可以使用Digicamcontrol同时使用多台摄像机（ http://digicamcontrol.com ）。有关摄像机位置的详细说明，以及从两个角度分析如何可以合并到根顶点的3D重建中（见图6），请参阅Bizet 等人（2016）。

图6.从两个正交的角度对根的三维重建。颜色表示相对根曲率。
连续监测期间的压力管理：程序B中描述的根生长监测系统可以适应于通过另一种解决方案替代营养液，同时不间断地监测生长并且不对根进行任何操纵（参见Bizet等人。 >，2015年，根据暴露于渗透胁迫使用该系统）。
1. 在增长监测室内设置根部之前，先将第二个缓冲罐（tank b ）与初始缓冲罐（tank a ）并联连接起来。 Tank b 包含测试解决方案，并应使用球阀（Thermo Fisher）连接到营养物流入（图7）。检查两个罐中溶液温度是否相同。
  
  图7.使用球阀设置双槽以应力应用
2. 从坦克关闭球阀b ，然后从步骤B1到B6。
3. 要更换循环溶液，请打开泵，关闭球阀从坦克a ，然后从罐中打开球阀b 。 />
4. 等待五分钟，以便更换生长监测室中的溶液，并将流出的柔性管从缓冲罐a 移动到缓冲罐b 。
5. 在实验结束时，清洗所有与营养液接触的物质。
该协议灵活适应物种和生长条件要求。监测引力根的生长，使用垂直生长监测室。对于体外植物，其根直径更细，可以通过相机上更多的延伸管获得更高的放大倍率，并且琼脂平板直接用作生长监测室。 >

数据分析

Kineroot的运动学分析提供了沿根顶点的速度值，即速度分布。沿根顶点的元素伸长率是速度分布的一阶导数。或者，专用于根速度分布的复合生长函数可以适用于Kineroot输出（Peters和Baskin，2006）。参见Bizet等人（2015）了解更多关于装配程序的细节。从这些轮廓中提取生长参数，如根生长速率（等于最大速度），生长区长度和最大元素伸长率（图8）。然后可以参考参数统计来分析这些参数，比较个人，或者检查对环境压力的响应的时间过程。

图8.速度和元素伸长率曲线。从Peters和Baskin（2006）拟合复合增长函数后的速度曲线（蓝色）和元素伸长率（EER，绿色）曲线。在生长参数中，根生长速率（RGR）对应于速度分布的最大值。最大EER对应于速度分布的最大斜率，即一阶导数的最大值。在最大速度的94％处确定生长区长度（GZ）以避免无限值。

笔记

根据我们的观察，生长速率在个体根之间变化非常大，在最小值和最大值之间变化高达5倍。实验设计应考虑到这种变异性，以最大限度地发挥统计学分析的力量。

致谢

FB得到法国国家教育和研究部的资助。该研究由法国国家研究机构通过卓越实验室ARBRE（ANR-12-LABXARBRE-01）和Agreenium的国际研究学院获得资助。詹姆斯·哈顿研究所接受苏格兰政府的资助。该协议由Bizet等人（2015）和Bizet等人（2016）进行了改编。

参考

Bastien，R.，Legland，D.，Martin，M.，Fregosi，L.，Peaucelle，A.，Douady，S.，Moulia，B.and Hofte，H。（2016）。＆lt; a class = ke-insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27354251“target =”_ blank“> KymoRod：棒状植物器官的自动运动学分析方法。植物J 88（3）：468-475。

Basu，P.，Pal，A.，Lynch，JP and Brown，KM（2007）。＆nbsp; 一种用于生长和曲率运动学研究的新型图像分析技术。植物生理学145（2）：305-316。

Bizet，F.Bengough，AG，Hummel，I.，Bogeat-Triboulot，MB和Dupuy，LX（2016）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi.nlm生长植物根部的3D变形场揭示了对轴向机械力的机械和生物反应。 67（19））：5605-5614。

Bizet，F.，Hummel，I.和Bogeat-Triboulot，MB（2015）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25540436 “target =”_ blank“>通过红外成像显示体内根尖分生组织的长度和活动。 66（5）：1387- 1395.

Erickson RO and Silk，WK（1980）。＆nbsp; 运动学的植物生长。 Sci Am 242（5）：134-151。

法语，A.，Ubeda-Tomas，S.，Holman，TJ，Bennett，MJ和Pridmore，T。（2009）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/19515787“target =”_ blank“>使用新型图像分析工具对根生长进行高通量定量。植物生理学150（4）：1784 -1795。

Iwamoto，A.，Kondo，E.，Fujihashi，H。和Sugiyama，M。（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 23076437“target =”_ blank“>使用新颖的图像分析程序进行拟南芥根系伸长的运动学研究植物研究126（ 1）：187-192。

List，A.，Jr.（1969）。＆nbsp; 瞬态Zea mays的主要根源的生长反应。植物 87（1-2）：1-19。

Merret，R.，Moulia，B.，Hummel，I.，Cohen，D.，Dreyer，E.和Bogeat-Triboulot，MB（2010）。＆nbsp; 使用流体力学形式主义监测生长器官中基因表达的调控。 BMC Biol 8：18.

Peters，WS和Baskin，TI（2006）。裁缝制作复合函数作为模型选择中的工具：S形和双线增长曲线的情况。工厂方法 2：11.

Sharp，RE，Silk，WK和Hsiao，TC（1988）。＆nbsp; 在低水势下的玉米初级根的生长：I.膨胀生长的空间分布。植物生理学87（1）：50-57。

van der Weele，CM，Jiang，HS，Palaniappan，KK，Ivanov，VB，Palaniappan，K.和Baskin，TI（2003）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12857796“target =”_ blank“>应用于根生长的高空间和时间分辨率的可变形运动的计算图像分析的新算法。在分生组织中大致均匀的伸长，并且在突然加速之后，在伸长区域中。植物生理学132（3）：1138-1148。